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Compl. de Bio et Élém. Génomique > Technique de biologie moléculaire 2 > Flashcards

Technique de biologie moléculaire 2 Flashcards

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Biology 101 flashcards
1
Q

Qu’est-ce que la méthode de détection par cytométrie en flux (FACS)?

A

Analyse multiparamétrique par fluorescence des propriétés physiques et chimiques de plusieurs milliers de particules (ex: cellules) par seconde.

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Q

Quelle analyse peut être faite avec la méthode de détection par cytométrie en flux (FACS)?

A
  • Constituant cellulaire (acides nucléiques, lipides, protéines de surface et/ou intracellulaires)
  • Organites isolés (noyaux, mitochondries, plastes, chromosomes)
  • Certains instruments permettent aussi l’isolation de populations de cellules précises.
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3
Q

Quelles informations sont obtenues par cytométrie en flux (FACS)?

A
  • Les phénotypes cellulaires (i.e. identification de populations dans des échantillons mixtes)
  • Les fonctions cellulaires (viabilité, prolifération, signalisation intracellulaire, activités enzymatiques, activité métabolique, pH, potentiels membranaires, activité ioniques)
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4
Q

Quelles sont les 3 parties qui compose le cytomètre en flux?

A

1) un réseau fluidique
-constitué d’une veine liquide s’écoulant à vitesse constante qui entraîne et focalise un deuxième flux liquide contenant l’échantillon.
2) un banc optique avec une ou plusieurs sources lumineuses monochromatiques et ses détecteurs
-du type photodiode (pour la diffusion de la lumière) et des photomultiplicateurs et filtres optiques qui permettent de quantifier les diverses fluorescences émises par chaque particule.
3) un microprocesseur
-qui convertit les signaux électriques en signaux numériques.

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5
Q

Qu’est-ce que FSC en cytométrie en flux?

A

Lumière réfractée en direction continue au rayon lumineux. Renseigne sur la taille de la particule et permet l’exclusion des doublets de cellules.

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6
Q

Qu’est-ce que SSC en cytométrie en flux?

A

Lumière réfractée dans une direction différente (mesurée à 90°C) du rayon lumineux. Renseigne sur la granularité/complexité de la particule.

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7
Q

Qu’est-ce que le principe des fluorochromes et de la fluorescence en cytométrie en flux?

A

Un fluorochrome est une molécule qui peut absorber l’énergie depuis une source lumineuse (i.e. Laser) et émettre des photons de moindre énergie (une longueur d’onde plus élevée), ce qu’on appelle la fluorescence.

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8
Q

Est-ce possible de d’analyser plusieurs paramètre simultanément en cytométrie en flux?

A

OUI, car
- il existe une panoplie de fluorochromes
- Cytomètre équipés de plusieurs combinaisons de lasers/détecteurs
Par contre, tous les fluorochromes disponibles ne peuvent cependant pas être utilisés simultanément, parce que les spectres d’excitation/émission peuvent être trop similaire d’un fluorochrome à l’autre.

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9
Q

Nommez des exemples d’analyse par cytométrie en flux (FACS)?

A
  • Immuno-phénotypage
  • Détection d’un gène rapporteur
  • Détection de la division cellulaire
  • Analyse de prolifération
  • Détection de la mort cellulaire par apoptose
  • Indicateur du métabolisme cellulaire
  • Triage cellulaire
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10
Q

Expliquez comment on fait pour détecter la division cellulaire par FACS.

A
  1. Agents fluorescents marquent l’ADN pour voir la distribution du contenu en ADN à travers les étapes du cycle cellulaire
  2. Algorithme de modélisation utilisé pour déterminer la proportion de cellules en phase G0/G1 par rapport à la phase S, G2
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11
Q

Expliquez comment on fait pour analyser la prolifération par FACS.

A

Utilise des colorants fluorescents perméables aux cellules pour mesurer le nombre de division (prolifération) des cellules.

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12
Q

Expliquez comment on fait pour détecter la mort cellulaire par apoptose par FACS.

A

Utilise la phosphatidylsérine (PS) qui se trouve généralement sur la feuille interne de la membrane plasmique.
- Plus l’apoptose progresse la PS se retourne vers la membrane externe, ce qui indique que les cellules doivent être phagocytées
- Annexine V se lie au PS
- Ajout colorant imperméable aux cellules vivantes permet de voir cellules apoptotique ou nécrotique

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13
Q

Expliquez comment on fait pour utiliser FACS comme indicateur du métabolisme cellulaire.

A
  • 2-NBDG (analogue du glucose fluorescent) est utilisé pour mesurer la propension des cellules à incorporer la glucose
  • Sondes fluorescentes de type Mito Tracker permettent de mesurer la masse et le potentiel membranaire mitochondriale
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14
Q

Expliquez comment on fait pour détecter le triage cellulaire par FACS.

A

Utilise des appareils qui permettent de récupérer une population de cellules d’intérêt identifiée par phénotypage.

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15
Q

Qu’est-ce que la détection des protéines par ELISA?

A

Analyse quantitative de la présence d’un antigène d’intérêt dans un échantillon biologique donné à l’aide d’anticorps et d’une réaction enzymatique colorimétrique. Il existe plusieurs types d’ELISA (direct, indirect, sandwich et compétitif).

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16
Q

Que permet la méthode de détection des protéines par ELISA indirect et sandwich?

A
  • Indirect: permet la quantification de titres d’anticorps sériques (ex: réponse humorale antigénique spécifique suite à une immunisation)
  • Sandwich: permet la quantification d’une protéine (ex: cytokine) d’intérêt.
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17
Q

Quelles sont les grandes étapes de la détection des protéines par ELISA?

A
  1. Absorption d’anticorps de capture par le pétri
  2. Les sites non-occupés sont bloqués à l’aide de protéines
  3. Incubation des échantillon
  4. Ajout d’un anticorps biotinylé
  5. Ajout d’un complexe enzyme (HRP)-Avidine
  6. Ajout du substrat de l’enzyme
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18
Q

Qu’est-ce que la détection des protéines par ELISPOT?

A

Même principe que l’ELISA de type sandwich, mais des cellules sécrétant l’antigène d’intérêt sont utilisées comme échantillons biologiques.

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19
Q

Qu’est-ce qui est mesurer avec la détection des protéines par ELISPOT?

A

L’ELISPOT permet de mesurer une quantité de cellules (ex: cellules T) qui répondent à un stimulus donné (i.e. antigène) en sécrétant une protéine d’intérêt (ex: une cytokine tel que l’interferon gamma par exemple).

20
Q

Quelles sont les grandes étapes de la détection des protéines par ELISPOT?

A
  1. Absorption d’anticorps de capture par le pétri
  2. Les sites non-occupés sont bloqués à l’aide de protéines
  3. Ajout de cellules (lymphocytes) + stimuli
  4. Lavage des cellules
  5. Ajout d’anticorps biotinylé
  6. Ajout d’un complexe enzyme (HRP)-Avidine
  7. Ajout du substrat de l’enzyme
21
Q

Qu’est-ce que la méthode de co-immunoprécipitation de protéines?

A

La co-immunoprécipitation de protéine vise à isoler des complexes composés de 2 (ou plus) protéines. Cette technique permet l’étude d’interaction entre plusieurs protéines.

22
Q

Quelles sont les grandes étapes de la co-immunoprécipitation de protéines?

A
  1. Extraction des protéines
  2. Ajout d’un anticorps monoclonal (protéine 1)
  3. Ajout de sépharose - protéine A (capable de lier l’anticorps)
  4. Précipitation des billes lié à l’anticorps
  5. Lavage
  6. Détection de la protéine 2 par Western blot
23
Q

Quelle est l’alternative possible utilisé dans la co-immunoprécipitation de protéines?

A

Billes de résine d’agarose couplées à l’anticorps.

24
Q

Qu’est-ce que la méthode de spectroscopie en fluorescence?

A

La microscopie en fluorescence combine les propriétés de magnification de la microscopie aux propriétés fluorescentes des fluorochromes. Cette technique permet d’identifier avec précision et en détail des cellules et ses composantes microscopiques.

25
Q

Quelles sont les différentes techniques de microscopie en fluorescence?

A
  • Utilisation du microscope confocal
  • Analyse par FRET
  • Analyse par FRAP
  • Immunomarquage à l’aide d’un anticorps couplé à un fluorochrome
  • Transfection de protéines fusionnées à une protéine fluorescente, typiquement, la GFP
26
Q

Qu’est-ce que la technique d’utilisation du microscope confocal de la microscopie en fluorescence?

A
  • Réalisation des images de très faible profondeur de champ appelées « sections optiques ».
  • En positionnant le plan focal de l’objectif à différents niveaux de profondeur dans l’échantillon, il est possible de réaliser des séries d’images à partir desquelles on peut obtenir une représentation tridimensionnelle de l’objet. L’objet est une image recomposée par ordinateur.
27
Q

Qu’est-ce que la technique d’analyse par FRET de la microscopie en fluorescence?

A

Le FRET utilise deux fluorochromes, un donneur qui va transmettre son énergie à un autre fluorochrome accepteur. Cette technique permet d’étudier des interactions entre deux molécules.

28
Q

Qu’est-ce que la technique d’analyse par FRAP de la microscopie en fluorescence?

A

Une protéine d’intérêt couplée à un fluorophore est introduite dans une cellule. Une zone particulière est ensuite éteinte par photoblanchiment. On mesure la restauration de la fluorescence.
-L’équation permet d’estimer la constante de diffusion de la protéine.

29
Q

Quelles sont les étapes de l’analyse par FRAP de la microscopie en fluorescence?

A
  1. Mesure la fluorescence d’une cellule/tissue avant le photoblanchiment
  2. La fluorescence d’une zone définie est éteinte par photoblanchiment à l’aide d’une intense source lumineuse (ex: laser)
  3. Le recouvrement de la fluorescence dans la zone photoblanchie est mesuré
30
Q

Qu’est-ce que la spectrométrie de masse?

A

Analyse qualitative et quantitative de milliers de molécules comprises dans un échantillon donné. Permet donc d’identifier des molécules dans un échantillon et de mesurer l’abondance de ces molécules.

31
Q

Sur quoi repose la spectrométrie de masse?

A

Sur le principe de l’ionisation (ajout de charge) des molécules et de la mesure du ratio masse/charge des ions produits.

32
Q

Que représente l’axe des «x» et «y» sur le graphique de spectrométrie de masse?

A

X: Ratio masse/charge
Y: Abondance relative (nb ions détectés)

33
Q

Puisque la majorité des charges sont de +1 en spectroscopie de masse, que représente le ratio m/z?

A

Représente principalement la masse atomique.

34
Q

Que précède généralement la spectrométrie de masse?

A

Il y a souvent une étape de séparation des molécules par chromatographie (liquide->LC-MS ou gazeuse->GC-MS) surtout pour séparer les isomères.

35
Q

Sur quel principe repose la chromatographie?

A

Sur le principe de l’affinité des différentes molécules avec des solvants.

36
Q

Qu’est-ce que la méthode Métabolomique: Stable Isotope Tracer Analysis (SITA)?

A

Analyse LC-MS qui permet de suivre le flux de réactions biochimiques auxquelles un substrat métabolique d’intérêt (ex: tracer) est soumis (ex: glucose, glutamine, etc).

37
Q

Qu’est-ce qui est l’avantage principalement utilisé en métabolomique SITA?

A

Cette technique prend avantage du fait que les isotopes se distinguent facilement en analyse de spectrométrie de masse puisque leurs masses diffèrent. Lors de l’analyse LC-MS, il est donc possible de mesurer le nombre d’atomes qui proviennent d’un tracer «isotopique» dans la composition d’un métabolite donné.

38
Q

Qu’est-ce que la méthode Métabolomique: analyse de flux extracellulaire?

A

Analyse du profil bioénergétique en temps réel de cellules adhérentes. Cette technique mesure les 2 voies métaboliques cellulaires principales: la glycolyse et la respiration mitochondriale.

39
Q

Qu’est-ce que la respiration mitochondriale?

A

La respiration mitochondriale (phosphorylation oxydative) utilise le catabolisme du glucose (pyruvate) et requiert la consommation d’oxygène.

40
Q

Qu’est-ce que le métabolisme glycolytique?

A

Le métabolisme glycolytique est caractérisé par le catabolisme du glucose jusqu’en lactate (acidification du milieu de culture).

41
Q

Quelles sont les étapes de la méthode de métabolomique: analyse de flux extracellualire?

A
  1. Des cellules sont ensemencées dans une plaque de culture (24-96 puits)
  2. Des composés (inhibiteurs, stimulateurs, substrats, etc.) sont ajoutés dans des ports (4X) compris dans la cartouche.
  3. La cartouche est déposée par-dessus la plaque de cellules en culture.
  4. La plaque et la cartouche sont insérés dans un instrument appelé Seahorse analyzer (ou XF analyzer).
  5. L’instrument mesure la teneur en oxygène (OCR) et l’acidité (ECAR) du milieu simultanément et en temps réel à l’aide de sondes et d’un système de fibre optique/fluorophores.
42
Q

Comment l’instrument détecte la teneur en oxygène et le pH en métabolomique: analyse de flux extracellualire?

A

L’instrument mélange le milieu des puits par action mécanique de la sonde (up and down). La sonde s’abaisse ensuite au fond du puits (sans toucher les cellules), et mesure l’O2 et le pH.

43
Q

Qu’est-ce qui est utilisé pour mesurer des paramètres relatifs à la respiration mitochondriale et à la glycolyse en métabolomique: analyse de flux extracellualire?

A

Des tests avec séquence d’injections précise de composées qui influencent l’activité métabolique des cellules de façon connue aide à mesurer:
- respiration basale, respiration couplée à la production d’ATP, respiration maximale, capacité de réserve (respiration mitochondriale)
- capacité glycolytique et de réserve (glycolyse)

44
Q

Est-ce que la méthode métabolomique: analyse de flux extracellualire permet de mesurer l’effet d’un composé sur les fonctions mitochondriales et le métabolismes glycolitique en parallèle?

A

Oui, car les sondes mesurent l’oxygène (OCR) et le pH (ECAR) simultanément.

45
Q

Quels sont les types d’applications de la méthode métabolomique: analyse de flux extracellualire?

A
  • Permet d’étudier l’effet d’un médicament sur le profil métabolique de différentes cellules.
  • Permet d’identifier des déterminants de l’activité métabolique cellulaire.

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