Technique de biologie moléculaire 3 Flashcards
Quels sont les utilités de la PCR en laboratoire?
- Séquençage de l’ADN
- Génotypage d’organismes modèles
- Clonage moléculaire/mutagenèse dirigée
- Amplification de cDNA (transcription réverse)
- PCR en temps réel (qPCR)
- Marquage de l’ADN (Southern Blot)
- Diagnostic médical
- Identification judiciaire
Quels sont les 5 composantes essentiels requise pour la PCR?
- la polymérase
- les amorces
- les désoxynucléotides triphosphates (dNTPs)
- le tampon
- la matrice d’ADN
Qu’est-ce qu’il se passe si un des 5 éléments est manquant pour effectuer une PCR?
La PCR ne fonctionnera tout simplement pas.
Quels sont les 3 étapes du cycle de la PCR?
A partir d’une séquence double brin d’ADN;
- dénaturation (95-98C)
-hybridation (50-70C)
- élongation (68-72C)
Ce premier cycle donne 2 segments d’ADN. On recommence les 3 étapes pour le 2e cycle pour chacune des 2 copies et on obtient 4 copies. Lors du 3e cycle, on obtient 8 copies dont 2 qui sont de longueur désiré.
À quel cycle nous obtenons des fragments amplifiés doubles brins sans ADN simple brin, de longueur désirée?
Lors du troisième cycle
Quelles sont toutes les étapes de l’amplification de l’ADN par PCR?
- Dénaturation initiale (95C)
- Dénaturation (95C)
- Hybridation (50-70C)
- Élongation (68-72C)
- Élongation finale (68-72C)
- Étape finale de refroidissement (4-15C)
Nommez les différentes polymérases qui peuvent être utilisées pour la PCR.
- Taq polymérase
- Pfu et Deep vent
- Phusion
- Pfx
- «Hot start»
Quelles sont les caractéristiques de Taq polymérase?
- thermostable à haute température
- agit à haute température
- Ne possède pas d’activité eexonucléase 3’ -> 5’, ne peut pas corriger ses erreurs (inconvénient)
- Inhibée par plusieurs molécules: EDTA, DMSO, urée, phénol, ethanol, etc (inconvénient)
- Ajoute un A à la fin du fragment généré, utile pour le clonage TA
Quelle est la différence entre la Taq et les autre polymerase?
La taq ne possède pas d’activité d’exonuclease 3’ -> 5’. Donc pas de correction des erreurs.
Quelles sont les qualités d’une bonne polymérase?
- Processivité: se défini par le nombre de nucléotides incorporées par un seul événement de liaison
-
Fidélité: se défini par la capacité de la polymérase à corriger ses erreurs par activité de relecture (proofreading,
activité 3’ -> 5’ exonucléase) - Spécificité: se défini par la capacité qu’a la polymérase d’être active seulement pour l’élongation, et de ne pas allonger l’ADN de manière non-spécifique
- Thermostabilité: se défini par la capacité de l’enzyme à ne pas se dénaturer pas au fil des cycles
Comment le lien phosphodiester se forme lors d’un ajout de nucléotide?
- Le lien phosphodiester est formé par une attaque nucléophile d’un 3’-OH libre du fragment d’ADN sur le 5’-alpha-PO4 du dNTP
- La polymérase, en utilisant le dNTP, catalyse l’ajout d’un phosphate lors de la formation d’un pont phosphodiester
- Un seul pyrophosphate inorganique PPi est libéré
Quels sont les différents types de matrices amplifiables par PCR?
- ADN génomique (ADNg)
- ADN plasmique
- ADN complémentaire (ADNc)
Qu’est-ce que les amorces?
Oligonucléotides complémentaires au brin à amplifier.
-toujours lue de la direction 5’ -> 3’
Quelles sont les types d’amorces et sur quel brin elles sont liées?
Il y a deux amorces qui se lient au fragment dénaturé et simple brin :
- L’amorce sens 5’ -> 3’, qui se lie au brin matrice (anti-sens)
- L’amorce anti-sens 3’ -> 5’, qui se lie au brin complémentaire (sens)
Que faut-il déterminer pour bien designer des amorces pour amplifier un fragment de PCR?
La température de fusion ou Tm
-température à laquelle la moitié de l’ADN est double brin et la moitié simple brin
-Tm est indicateur de la stabilité du duplex d’ADN
Quel est le lien entre Tm et les séquences riche en GC?
Plus la séquence est riche en GC, plus Tm sera élevé dû à la présence d’un pont hydrogène de plus.
À quelle température les amorces produisent les meilleurs résultats?
À un Tm entre 52-58 C
Comment on calcul la température d’hybridation de l’amorce?
En fonction de Tm, mais un peu plus basse (-2 à 5 degré que Tm).
Qu’est-ce qui influence la température d’hybridation?
- La concentration des amorces qui sera utilisée
- La concentration des sels dans le tampon
- L’utilisation de DMSO dans le tampon pour les séquences riches en GC peut diminuer le Tm de 0.5 degré C/%DMSO
Quelles sont les caractéristiques à avoir pour obtenir un bon design d’amorce pour bien réussir sa PCR?
- Amorce de 15-30 nucléotide de long
- Tm de 55-70 C, et pas plus de 5 degré C de différence entre les 2 amorces
- 40-60% GC
- Idéalement un C ou G à l’extrémité 3’
Quelles sont les caractéristiques à éviter dans le design d’amorce pour bien réussir sa PCR?
- Structure secondaire de type tête d’épingle (hairpin)
- Complémentarité entre les amorces (dimères)
- Répétitions
- Plus de trois C ou G à la fin de la séquence
- Ces structure/complémentarités sont vérifiables à l’aide d’algorithmes
À quoi sert le gel d’agarose?
Le gel d’agarose nous permet de séparer l’ADN par grosseur de fragments, et de le visualiser pour l’analyser.
Qu’est-ce qui est possible lors du clonage moléculaire?
Il est possible d’ajouter des sites de restriction aux amorces complémentaires à l’ADN, afin de pouvoir cloner ce fragment dans un vecteur de son choix.
-Fragment PCR avec extension spécifique et digéré avec les enzymes ligué par l’ADN ligase au vecteur digéré par des enzymes
Que permet la mutagénèse dirigée?
Permet de spécifiquement muter l’ADN d’un plasmide par PCR (la séquence codante d’un gène), et ainsi la protéine produite se retrouve mutée (un ou des acides aminés, mutation faux-sens ou non-sens, insertions, délétions, etc).
À quoi sert la mutagénèse dirigée? Qu’est-ce qu’on peut apprendre avec cette méthode?
- Créer des nouveau « mutants » d’un gène X pour mieux comprendre la fonction de sa protéine (structurefonction, interaction protéineprotéine, activité, etc.).
-
Comprendre la fonction d’un acide aminé en particulier au sein d’une
protéine. - Commercial: ingénierie des protéines mutantes plus performantes.
Quelles sont les 2 étapes de la RT-PCR?
- La fabrication d’un ADN complémentaire (ADNc) par transcription réverse (RT pour reverse transcription) à partir d’une matrice d’ARNm à l’aide de la transcriptase réverse
- L’amplification de l’ADNc avec une PCR
Quel est le lien entre l’expression d’un gène et la transcription en ARNm?
Expression d’un gene = transcription en ARNm!!!!!
-Très très souvent si un gène est exprimé, il va être transcrit en ARNm
Quelles sont les 3 activités spécifique des transcriptases réverses (qui sont des ADN polymérases)?
- ADN polymérase ARNdépendante ayant besoin d’une amorce d’ARN (ou d’ADN) pour synthétiser l’ADNc simple brin hybridé à l’ARN
- Une activité endonucléase de type ARNase H pour dégrader l’ARN de l’hybride ARN/ADN
- Optionnel: une activité ADN polymérase ADNdépendante capable de synthétiser un brin complémentaire à l’ADNc simple brin, et le convertir en ADNc double brin
Quels sont les types d’amorces de la transcrisption réverse (RT)-PCR?
- Amorces «oligo dt»
-amplifie la queue poly(A) de l’ARNm - Amorces «hexamères»
-amplifie non-spécifiquement tous les ARNs: l’ARNm et aussi les autres types d’ARNs
Est-ce que les oligo dt amplifie un ARNm spécifique?
- Non, les oligos dT n’amplifient pas un ARNm spécifique, mais bien tous les ARNm.
- Pour amplifier une séquence d’ARNm spécifique, il faut utiliser des amorces complémentaires à cette région spécifique de l’ARNm
Qu’est-ce qu’une transcriptase réverse
ADN polymérases qui peuvent synthétiser un brin d’ADN complémentaire (ADNc ou cDNA) en prenant de l’ARN comme matrice.
Que permet la PCR en temps réel quantitative?
PCR en temps réel/quantitative permet de déterminer la quantité relative d’ARNm entre 2 échantillons.
Quelles sont les différentes phases graphiques d’accumulation du signal de fluorescence pendant la PCR en temps réel quantitative?
- Baseline
- Ct
- Phase exponentielle
- Plateau
Qu’est-ce que le Ct?
Cycle seuil, le nombre de cycles ou le produit d’amplification d’ADN par qPCR peut être détecté au-dessus du signal de bruit-de-fond.
Quels sont les deux types de sondes fluorescentes utilisées pour le qPCR?
- Sonde fluorescente SYBR Green qui se lie sur l’ADN double brin, donc après l’élongation
- Sonde se type «5’ nucléase» ou FRET
À quelle étape du cycle il y aura une accumulation de signal fluorescent avec la méthode de qPCR FRET ou 5’ nuclease?
- La fluorescence est «éteinte» par la molécule extinctrice jusqu’à temps que la sonde fluorescente est libérée par l’activité 5’ -> 3’ exonucléase de la polymérase
- La molécule extinctrice ne peut plus éteindre le signal du fluorophore, qui peut émettre de la fluorescence quantifiable en temp réel
Comment lire le graphique de Ct en fonction de la norm. fluoro. ?
Plus le Ct en petit (proche de 0), plus l’ARNm du gène d’intérêt est abondant.
- plus le Ct est petit, moins on a besoin de cycle d’amplification pour avoir assez d’ARNm qui peut être détecté
Que peut-on comprendre du fait qu’on peut écrire un message avec de l’ADN?
L’ADN est un excellent moyen de « stocker » de l’information, et qu’on peut contrôler la taille des fragments d’ADN (par digestion d’un plasmide avec des enzymes de restriction, en créant un patron de digestion spécifique donnant différentes tailles de fragments d’ADN) pour créer un message en migrant cet ADN sur un gel d’agarose.
