Technique de biologie moléculaire 4 Flashcards
À quoi donne lieu les différentes expressions des gènes dans une cellule?
- La différentiation cellulaire
- Le développement
- La complexité phénotypique des espèces vivantes
Qu’est-ce qui affecte l’expression des gènes?
- Le profil épigénétique dans la cellule en question
- Le métabolisme cellulaire
- Les mutations
Que permet l’étude de l’expression des gènes?
- Comprendre les phénomènes physiologiques et physiopathologiques,
- Mettre en valeur de fonctions spécifiques à un tissus, une condition
- La médecine personnalisée
Quelles sont les caractéristiques de l’expression génique?
- Chaque cellule possède un profile d’expression génique qui lui est propre.
- L’ensemble de la distribution de l’expression des gènes constitute son profil d’expression
Qu’est-ce qu’un profile d’expression génique?
- Le profile d’expression des gènes est une image captée de manière instantannée, au niveau moléculaire
- Le profile d’expression des gènes représente la distribution de l’expression d’un ensemble de genes pour une ou plusieurs conditions.
- Pour bâtir un profile d’expression nous avons besoin de connaitre les sites où les genes sont exprimés (tissus, cellules)
Quels sont les 2 paramètres essentiels lors de l’étude de l’expression génique?
- l’échantillon de référence
- les gènes de contrôle interne
Qu’est-ce qu’un échantillon de référence?
- Il représente l’état de base «normal» auquel seront comparés les niveaux d’ARN des échantillons expérimentaux.
- C’est la condition de base par rapport à laquelle on établira que l’expression d’un gène est augmentée ou diminuée dans l’échantillon expérimental.
Qu’est-ce que les gènes de contrôle interne? À quoi ils servent?
- Le gène de référence (contrôle interne) doit être un gène dont l’expression ne présentent aucune variation entre les conditions des échantillons étudiées. On peut utiliser plus d’un gène de contrôle interne.
- Ils sont utilisés pour normaliser les valeurs d’expression de gènes obtenus entre les différents échantillons étudiés.
Que permet la méthode de détection et qualification de l’expression génique Northern Blots?
Permet de détreminer la taille de l’ARN et des variants d’épissage alternatifs d’un gène.
Quelles sont les étapes de la méthode Northern Blots?
- Isolation de l’ARN totale ou Poly(A)n-positive
- Migration sur un gel dénaturant d’agarose (avec formaldehyde pour séparer les tailles d’ARN)
- Transfert sur membrane (nylon, sous vide)
- Cible d’ARN est détectée par hybridation avec sonde radiomarquée (a-P32) complémentaire
- L’ARN ayant hybridé avec la sonde radiomarquée sur la membrane est détectée par autoradiographie
- L’intensité du signal resultant est proportionnel à la quantité d’ARN présent dans l’échantillon
Qu’est-ce qu’on peut identifier avec l’intégration du signal Northern Blot?
La distance de migration et l’intensité de la bande sur le film nous informe sur la taille et la quantité de l’ARN d’intérêt dans notre échantillon.
Comment le signal peut-il être normalisé dans un Northern Blot?
- Résultats souvent normalisés en comparaison aux gènes de maintenance (housekeeping genes: Beta-actin, GAPDH, 18S).
- Le but de la normalization est d’éliminer toute difference apparente causée par le transfert inégal des ARN sur la membrane ou les quantités inégales d’ARN chargées sur le gel.
Quelles sont les précautions à prendre lors de la méthode Northern Blot?
Puisque le Northern blot distingue les ARNs par leur tailles, l’intégrité des échantillons est essentielle pour que le signal soit perçu come une seule bande (non-degrade)
- Les échantillons d’ARN partiellement degrades donneront lieu à un signal diffus ou réparti sur plusieurs bandes avec une perte générale de sensibilité.
Quels sont les avantages et les inconvénients du Northern Blots?
Avantages:
- Méthode historiquement bien connu et protocols bien établis
- L’utilisation de sondes radioactives la rend très sensible sur une large plage de tailles
- Largement utilisé pour obtenir la taille des ARNm et discriminer les produits d’épissage alternatifs
Inconvénients:
- Utilisation de réactifs radioactifs qui rendent la procédure longue et potentiellement dangereuse
- Quantification se fait par la mesure de l’intensité des bandes sur la membrane donc moins précis
- Il existe des alternatives non radioactives
- Se limite à la détection d’ARN précis connue
- Ne permet pas la découverte de nouveaux gènes différentiellement exprimés entre les échantillons
Qu’est-ce que la méthode d’Essai de protection à une nucléase (RPA)?
Méthode qui permet de révéler la presence d’ARN de sequences connues (même si presents en faibles quantités) dans un échantillon hétérogène d’ARN extrait des cellules.
