Technique de biologie moléculaire 6 Flashcards
Que compose un microscope composé?
2 lentilles
- lentille d’objectif (proche de l’objet observé) -> image réelle
- l’occulaire -> image virtuelle
Quelles sont les différents types de microscopie optique avec lumière?
- Lumière brillante
- Lumière opaque
- Contraste de phase
- Contraste interférentiel différentiel (DIC)
- Polarization
Qu’est-ce qu’un fluorophore et fluorescence?
- Fluorophore: molécule/protéine qui peut être excité par la lumière.
- Fluorescence: l’émission d’un photon après que le fluorophore excité resdescende à son niveau d’énergie basal
Quel est le lien entre la longueur d’onde et le niveau d’énergie?
Plus la longueur d’onde est petite -> plus le niveau d’énergie est élevé
Comment fonctionne la microscopie de fluorescence?
La microscopie de fluorescence utilise une source lumineuse pour exciter le fluorophore, via:
1. Filtre d’excitation
2. Objectif
3. Échantillon
4. Objectif
5. Filtre d’émission
Quelle est la différence entre l’immunofluorescence directe et indirecte?
- Directe: un anticorps primaire (qui cible la protéine d’intérêt ou antigène) est déjà couplé à un fluorophore, pour permettre la visualisation directe en microscopie à fluorescence
- Indirecte: un anticorps primaire est utilisé pour reconnaître la protéine d’intérêt, et ensuite, un
anticorps secondaire couplé à un fluorophore, reconnaît l’anticorps primaire. Le fluorophore présent sur l’anticorps secondaire permet la visualisation indirecte de la protéine d’intérêt en microscopie à fluorescence
Qu’est-ce qui est une découverte majeure de la microscopie optique à fluorescence? Pourquoi?
La GFP ou protéine fluorescente verte, car c’est une excellente ressource pour voir ou comparer les spectrer et caractéristiques des protéines fluorescente
- Des centaines de protéines fluorescentes existent de nos jours et peuvent être fusionnées à une protéine en N- ou C-terminal, pour pouvoir la visualiser en temps réel ou en immunofluorescence.
Quelles sont les différences entre l’épifluorescence et la microscopie confocale?
- Épifluorescente:
-type de microscopie à large champ (widefield) qui utilise une source de lumière comme l’UV pour exciter les fluorophores. - Confocale:
-l’utilisation d’un laser comme source lumineuse pour exciter les fluorophores avec une longueur d’onde précise.
-la présence d’un filtre « tête d’épingle » ou pinhole qui coupe la lumière horsfocus/hors champ, et permet donc d’imager un plan focal, donnant une image de haute résolution.
Qu’est-ce que la microscopie à deux-photons?
- Utilise deux photons de lumière à basse énergie (longueur d’onde plus grande) pour exciter un fluorophore
- Excitation et émission confinée à un point focal beaucoup plus petit
- Va profondément dans l’échantillon
- Moins de phototoxicité
- Utlisé en neurobiologie
Qu’est-ce que la microscopie à nappe de lumière (light sheet)?
- Illumine une très mince section optique de l’échantillon de manière perpendiculaire
- Excellente résolution et bonne rapidité
- Permet d’imager des échantillons intacts avec moins de phototoxicité
Quelle sont les techniques de microscopie de superrésolution?
STED, STORM et PALM
- microscopie monomoléculaire
Qu’est-ce que la microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF)?
Le TIRF utilise la réflexion totale interne du rayon laser pour exciter l’échantillon et permet de visualiser ce qui se passe à la base de la cellule.
- C’est un type de microscopie monomoléculaire.
À quoi sert FRAP?
Permet de mesurer la mobilité/dynamique de diffusion des fluorophores suite à une redistribution de fluorescence après un photoblanchiment.
Quelles sont les étapes de FRAP?
- Prend une image d’une cellule exprimant un marqueur fluorescent
- Photoblanchiment de la région d’intérêt avec un laser
- Reprend des images et observe si la fluorescence s’est redistribuée
Est-ce possible qu’une portion ne recouvre jamais leur fluorescence à cause du photoblanchiment?
OUI, il y a toujours une fraction immobile.
