Protéines Recombinantes I - Insuline Flashcards
Où agissent les protéines thérapeutiques?
À l’extérieur de la cellule.
Qu’est-ce que les protéines thérapeutiques?
Protéines recombinantes produites par des cellules dont le matériel génétique a été modifié par recombinaison de l’ADN):
- Agonistes
- Anticorps
- Antigènes (vaccins)
Qu’est-ce que les régions codantes?
Régions qui se retrouve sur l’ARNm (part de l’ARnm pour former l’ADN recombinante) et encode pour un polypeptide.
Qu’est-ce qu’une protéine recombinante?
Un fragment ADN d’intérêt produit par des cellules dont l’ADN a été modifié (recombiné) par recombinaison génétique et ensuite isolé à partir d’un organisme qui est cloné dans un vecteur (fragment d’ADN capable de réplication autonome et de lire l’information du transgène).
Que permettent les reverse transcriptase?
Permettent de passer d’un brin d’ARN à un ADnc double-brin.
Quelles sont les 2 formes de reverse transcriptase sous formes recombinantes?
1) AMV: avian myeloblastosis virus
2) MuLV: murine leukemia virus
Quelles sont les principales fonctions de la reverse transcriptase?
- Activité de l’ADN polymérase dépendant de l’ARN
- Activité RNAse H
Sur quoi s’appuie le procédé biotechnologique du système de production adapté à la fabrication d’une protéine recombinante, au sens large?
1) l’emploi d’un vecteur d’expression (en général un plasmide ou un virus -pour les vecteurs eucaryotes-), jouant le rôle de transporteur génétique du gène d’intérêt codant pour la protéine recherchée
2) l’utilisation d’une cellule hôte, chargée d’exécuter les instructions fournies par le gène d’intérêt qui lui est inséré, dans l’objectif de synthétiser la protéine
recherchée
3) une phase de production proprement dite permettant de fabriquer les volumes de protéines souhaités
4) une séparation et extraction de la protéine du milieu de culture, suivie par une purification de celle-ci.
Par quoi est caractérisé le système de production de protéines recombinantes au sens restreint?
Par un couple constitué d’un vecteur d’expression et d’un hôte (cellule ou organisme).
Quelles sont les grandes lignes de la production d’une protéine recombinante?
- Identification de la source (tissu/cellules) responsable de la production du biologique (la protéine recombinante)
- Trouver la séquence ARNm (Blue print)
- Design oligonucléotides; RT-PCR (production d’ADNc); PCR (amplification de l’ADNc sous forme double-brin (ds-ADNc) et prêt au clonage)
- Clonage de l’ADNc dans un vecteur d’expression choisi et séquençage (on veut que cette recombinaison génétique entre l’insert et le vecteur produise une construction plasmidique permettant la production d’une protéine fonctionnelle)
- Amplification construction plasmidique
- Insertion de la construction dans l’hôte (transformation/transfection)
- Production de la protéine par l’hôte
- Purification de la protéine recombinante
Quelles sont les étapes pour produire de l’insuline recombinante?
- Produire de l’ADNc codant pour l’insuline à partir de l’ARNm de l’insuline
- Introduction de l’ADNc de l’insuline dans un plasmide
- Production de l’insuline à paritr d’organismes (bactéries/levures) exprimant un plasmide contenant l’ADNc de l’insuline
Qu’est-ce qui est nécessaire de savoir afin de produire l’ADNc codant pour l’insuline à partir de l’ARNm de l’insuline?
Les processus de synthèse naturelle de la protéine à synthétiser:
1. Production de la préproinsuline au niveau du RE
2. Oxydation des résidus cystéines et clivages par protéases
3. Stockage de l’insuline dans de vésicules de sécrétions dans des cellules spécialisées du pancréas
Quelles chaînes compose l’insuline?
- Chaîne alpha: 21 a.a
-21 a.a: 21 codons de 3 nucléotides = 63 nucléotides - Chaîne beta: 30 a.a
-30 a.a: 3 nucléotides = 90 nucléotides
Comment trouve-t-on la séquence qui encode pour alpha et beta? Quelles sont les étapes de bases?
- ARN polymérase II lit le gène et produit un ARNm (ARNm = partie codante, pas d’intron)
- Isole et amplifie l’ARNm
Qu’est-ce que les reverses transcriptases ont permis d’accomplir?
Permettent de se servir de l’ARN comme matrice en passant d’un brin d’ARN à un ADNc double-brin.
Quelle est la longueur minimale d’une amorce?
Minimum 18 nucléotide (jusqu’à maximum 30) afin d’éviter les appariements avec d’autres endroits.
Comment peut-on créer un design d’amorce pour l’amorce #1 de la réverse transcriptase?
- Trouve la partie importante de l’ARNm (chaîne beta par exemple)
- Trouve la fin de la région de la chaîne beta (3’)
- Trouve les nucléotide complémentaire de cette séquence (brin d’ADNc néosynthétisé monocaténaire)
- Amorce #1 pour la réverse transcriptase commence de la fin vers le début (3’ à 5’ de la séquence d’ARNm, sens inverse, mais brin complémentaire 5’->3’)
Comment peut-on créer un design d’amorce pour l’amorce #2 pour l’ADN polymérase ?
- L’amorce #2 va commencer au début 3’ du brin d’ADNc néosynthétisé monocaténaire
- Trouve nucléotides complémentaires du brin d’ADNc
Que doit-on effectuer afin de produire la chaîne beta de l’insuline avec le fragment d’ADNc?
Le fragment d’ADNc doit être amplifié et incorporer dans un système d’expression:
- Polymerase Chain Reaction (PCR); amplification (picogrammes à microgrammes)
- Construction plasmidique (ADN recombinant); clonage du produit de PCR dans un vecteur d’expression (nanogrammes)
- Amplification du couple vecteur-insert (milligrammes); midi/maxiprep
- Incorporation dans hôtes : Bactéries ou levures
Pour l’introduction de l’ADNc de l’insuline dans un plasmide quel est le rôle de:
1. Modification des plasmides
2. Promoteur
3. Molécule d’ADN d’intérêt
4. Origine de réplication
5. Sélection
- Modification des plasmides: permettre l’expression de la molécules d’ADN d’intérêt et cela dans les bactéries
- Promoteur: production d’une grande quantité d’ARNm codant pour la protéine recombinante
- Molécule d’ADN d’intérêt: ce qui est inséré dans le plasmide (insert)
- Origine de réplication: permet au plasmide d’être maintenu dans la bactérie
- Sélection: permet de sélectionner les bactéries qui ont reçu le plasmide qui code pour un gène de résistance
Quelles sont les étapes dans le tube (Résumé)?
- Reverse transcriptase: ARNm -> ADNc
- PCR: petit ADNc -> ADNc plus gros
- Clonage de l’ADNc dans un vecteur
- Transformation pour Maxi-prep: ADNc-Vecteur plus gros
- Bon vecteur pour production de la protéine recombinante?
- OUI: Transfromation/transfection, phase de production et purification
- NON: sous-clonage, maxi-prep… transfromation/transfection, phase de production et purification
Quelles sont les différents système/hôtes de production de protéines recombinantes?
- E. Coli
- Saccharomyces cerevisiae
- Cellules CHO
Qu’est-ce qu’il y a de particulier avec E. Coli pour la production de protéines recombinantes?
Elle fut et reste encore le premier hôte utilisé pour la fabrication de protéines recombinantes
Quels sont les avantages de E. Coli pour la production de protéines recombinantes?
- Génétique bien connu
- Facile à utiliser
- Culture de masse en fermenteur
- Taux d’expression élevé -> produit quantités appréciables de protéines (+ 10% masse de protéines bactérienne)
- Peu coûteux
Quels sont les inconvénients de E. Coli pour la production de protéines recombinantes?
- Formation de corps d’inclusion
- Faibles sécrétion des protéines recombinantes
- N’effectue pas les modifications post-traductionnelles des protéines
Qu’est-ce que saccharomyces cerevisiae?
De la levure de boulanger, utilisée depuis des millénaires dans l’alimentation humaine.
Quels sont les avantages des saccharomyces cerevisiae pour la production de protéines recombinantes?
- Matériel génétique simple
- Ne présente aucune toxicité
- Bons taux d’expression des protéines
- Levure capable de fabriquer des protéines plus complexes et de réaliser des modifications post-traductionnelles
Quels sont les inconvénients des saccharomyces cerevisiae pour la production de protéines recombinantes?
- Protéines obtenues à l’intérieur du cytoplasme
- Nécessitent de casser la cellule afin de les récupérer.
- Sécrétion possible, mais en général au détriment des rendements (fonctionne bien petits polypeptides comme l’insuline, mais beaucoup moins bien pour des protéines complexes et de grandes tailles
Qu’est-ce que les cellules CHO?
Chinese Hamster Ovary
Quels sont les avantages des cellules CHO pour la production de protéines recombinantes?
- Utilisé pour des vaccin
- Se prêtent très bien à la culture de masse en bioréacteur
- Capacité à synthétiser des protéines complexes de poids moléculaire élevé
- Effectue des modifications post traductionnelles des protéines
Quels sont les inconvénients des cellules CHO pour la production de protéines recombinantes?
- Rendements faibles (de l’ordre de 10 milligrammes par litre au maximum)
- Fragiles
- Coûteuse
- Hétérogénéité génétique
