Struktur und Funktion der Proteine II

Question 1

Wie funktioniert die Proteinreinigung in der Dialyse?

Answer 1

1. Makromoleküle werden im Schlauch zurückgehalten
2. Niedermolekulare Pufferkomponenten können sich frei über die submikroskopischen Poren
   frei zwischen Außen- und Innenbereich des Schlauchs bewegen
3. Nach mehrmaligem Austausch des Zielpuffers ist der Ausgangspuffer fast vollständig verdünnt

Question 2

Was macht ein Western-Blot? Wie funktioniert er?

Answer 2

Prinzip:
Übertragung von Proteinen von einem Elektrophoresegel auf eine Membran durch eine senkrecht zum Gel angelegte elektrische Spannung

Ergebnis:
Die im Gel nach ihrer Größe aufgetrennten Proteine befinden sich auf der Membran, wobei das in der Elektrophorese erzeugte Bandenmuster erhalten bleibt.

Question 3

Wie funktioniert der Nachweis von Antikörperbindung?

Answer 3

1. sekundäre Antikörper ist mit dem Enzym AP (Alkalische Phosphatase) verknüpft
2. AP dephosphoryliert das farblose Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP)
3. Danach kommt es zu einer gekoppelten Redoxreaktion mit
   Nitroblautetrazolium (NBT)
4. Produkte: blauviolette, unlösliche Substanzen, die als Präzipitat auf dem Blot eine Farbbande erzeugen

Question 4

Wie funktioniert Sandwich-ELISA?

Answer 4

1. Proteingemisch wird auf eine antikörperbeschichtete Titerplatte gegeben
2. Der Primärantikörper erkennt und bindet sein Antigen
3. Nach Waschen wird ein enzymgekoppelter Zweitantikörper zugegeben, der sich an andere Bindungsstellen des Proteins setzt als der primäre Antikörper
4. Der entstandene „Sandwich“ wird durch eine Substratreaktion
   nachgewiesen

Question 5

Wie funktioniert das Trennprinzip der Gelfiltrationschromatographie?

Answer 5

1. Poröse Gelkügelchen erlauben kleinen Proteinen Zutritt, sperren große Proteine dagegen aus
   - große Proteine wandern daher schneller durch die Säule als kleine Proteine
2. Proteingemisch wird am oberen Ende einer Säule
   aufgetragen, die mit einem Gel (stationäre Phase) und einem Puffer (mobile Phase) gefüllt ist
3. Proteinkomponenten werden am unteren Ende in Fraktionen
   aufgefangen, wobei große Proteine schneller eluieren.
4. Die Zonen, in denen die Proteine sich bewegen, verbreitern sich
   während des Chromatographielaufs durch Diffusion

Question 6

Wie funktioniert das Prinzip der Ionenaustauschchromatographie?

Answer 6

Die Gelpartikel der stationären Phase sind so engmaschig, dass praktisch keine Proteine hier einzudringen vermögen:

Daher erfolgt keine Trennung nach Molekülmasse.

Question 7

Wie funktioniert das Chromatogramm eines Kationenaustauschers?

Answer 7

1. Proteingemisch wird auf die Säule aufgetragen und mit Puffer eluiert.
2. Negativ geladene und neutrale Proteine passieren die Säule;
   positive Proteine werden von den CM-Gruppen zurückgehalten
3. Steigende Konzentrationen von Natriumchlorid im Elutionspuffer
   („Salzgradient“) eluieren zuerst schwach bindende Proteine und dann die
   fest bindenden Proteine
4. Das von der Säule eluierte Protein wird über seine Absorption bei der
   Wellenlänge 280 nm photometrisch verfolgt

Question 8

Wie funktioniert die Affinitätschromatographie?

Answer 8

1. DNA-Molekül wird kovalent an die Matrix gekoppelt und als „Köder“ für einen Transkriptionsfaktor angeboten, der es erkennt und bindet.
2. Andere Proteine passieren die Säule ungehindert und werden abgetrennt
3. Durch Zugabe eines Überschusses an freien Oligonucleotiden wird der
   Transkriptionsfaktor aus der Matrixbindung freigesetzt und in stark
   angereicherter Form eluiert.

Question 9

Wie funktioniert die Isoelektrische Fokussierung?

Answer 9

1. Ampholytgradient, der im Polyacrylamid chemisch verankert ist, erzeugt einen linearen pH-Gradienten von Anode zu Kathode.
2. Ein Protein wandert, von Anode oder Kathode kommend, zu dem pH, der seinem isoelektrischen Punkt entspricht.
3. Jede Diffusion von Proteinen wird durch Refokussierung auf den isoelektrischen Punkt kompensiert. Hierdurch entstehen auf dem Gel sehr scharfe Banden

Question 10

Was ist der MALDI-TOF? Wie funktioniert er?

Answer 10

• MALDI = martix-assisted laser desorption ionization
• TOF = time of flight

1. Proteine werden mittels eines Lasers aus einer Martix geschossen
2. Sie gelangen so kurzfristig in einen gasförmigen Zustand
3. Die freien Proben werden durch eine Elektrode beschleunigt (Kathode oder Anode)
4. Anschließend durchfliegen sie in eine feldfreie Strecke und werden nach ihrer Geschwindigkeit aufgetrennt