Realtids-PCR

Question 1

Vilka är de två huvudgrupperna av metodik och vilka diagnostiska metoder finns hos varje?

Answer 1

Indirekt: serologi, klinisk bild
Direkt: mikroskopi, odling, antigenspåvisning, molekylärbiologisk

Question 2

Vad påvisar serologi?

Answer 2

Påvisande av antikroppar mot specifika antigen, och kan då vara genom

1. ELISA
2. IFA (immunofluorescent antipodi assay)
3. Immunoblot

Question 3

Vad påvisar mikroskopi?

Answer 3

Elektronmikroskop för virus då de är väldigt små.

Question 4

Vad påvisar odling?

Answer 4

Är fr.a. bakterier som odlas fram på agarplatta.

Virus som ska odlas kräver cell- eller vävnadskultur som är mottaglig för viss virusinfektion.

Question 5

Hur fungerar antigenspåvisning?

Answer 5

Antikroppar används för att hitta protein. Sker fr.a. genom ELISA.

Question 6

Vad innefattar molekylärbiologiska diagnostik?

Answer 6

Konventionell PCR, realtid-sPCR, microarray eller DNA-sekvensering. Letar efter gener eller genfragment.

Question 7

Vad är fördel och nackdel med serologi?

Answer 7

Fördel: lätta att göra, billigt, snabbt
Nackdel: låg specificitet d.v.s. kan ge falskt positivt (svår att skilja på aktiv och tidigare infektion), kan korsreagera

Question 8

Vilka är de olika sjukdomsfaserna och hur påverkar de diagnostiken?

Answer 8

De delas fr.a. in i akuta fasen och “läkningsprocess” (såvida det inte är en kronisk sjukdom).
Den akuta fasen har hög andel viremi, och håller i cirka fyra dygn. Här går det att göra ett qPCR.
Läkningsprocessen är när antikroppar börjar bildas, först IgM och sedan IgG. Detta börjar ordentligt efter cirka en vecka och kan då testas serologiskt.

Question 9

Vilka är fördelar och nackdelar med mikroskopering?

Answer 9

Fördel: hittar nya agens

Nackdel: avancerad utrustning, kräver kunnig personal, och är okänslig

Question 10

Vilka är fördelar och nackdelar med odling?

Answer 10

Fördel: stark indikation för infektion

Nackdel: långsam, okänslig, vissa virus saknar rätt cellkultur för att kunna växa

Question 11

Vilka är fördelar och nackdelar med molekylärbiologi?

Answer 11

Fördel: snabb, känslig

Nackdel: kan inte skilja på levande eller döda organismer, känslig för kontamination

Question 12

Vilka är de tre processen som sker innan PCR? Vad behöver de?

Answer 12

1. Lysera/förstöra celler: mekaniskt, kemiskt, enzymatiskt
2. Rena fram nukleinsyror: pH eller etanol/isopropanol. DNA kommer då fälla ut och fastnar lättare på vatten, samtidigt som det konkurrerar ut det.
3. Lägga till nödvändiga reagens

Question 13

Vilka är de nödvändiga reagenserna?

Answer 13

DNA templat: kan vara komplement d.v.s. cDNA
Primer: två eller fler för att markera sekvensen som ska amplifieras.
dNTP: måste matcha den nya strängen
Buffert: för enzymerna ska fungera
Taq-polymeras: överlever värme vid separation av dubbelsträngade DNA

Question 14

Hur sker termiska cykler?

Answer 14

1. Aktivering: av taq-polymeras. Värmen höjs.
2. Denatuering: samma värme.
3. Annealing: primers binder in, värmen sänks
4. Extension: värmen höjs lite

Question 15

Hur börjar själva PCR-processen?

Answer 15

1. DNA-polymeras har bundit in
2. Hög värme separerar dubbelsträngar
3. Annealering: primer binder till varsin ände av de två kopiorna som är komplementära mot varandra
4. Taq-polymeras binder in till primer
5. Nya kopior av mallen görs
   Cykeln upprepas 1-7 gånger.

Question 16

Vad händer efter PCR-processen?

Answer 16

Analysering av produkterna genom att kolla storlek, produkt och amplifiering. Därefter kan PCR-produkten undersökas genom agarosgel och polaritet och leta efter sekvensering, eller kloning m.m.