Kapitel 8 - Virenabreicherung

Question 1

Wodurch können Kontaminationen auftreten?

Answer 1

• Kontaminationen der Zelllinie

- zufälliges Einbringen von Viren während der Produktion

Question 2

Wodurch wird das Risiko für Zellkulturen möglicherweise hervorgerufen?

Answer 2

• zufällige Virenkontamination
  o durch kontaminiertes Rohmaterial o oder bei Prozess eingebracht
• Nager-Zelllinien (Mäuse, Hamster, …), die endogene retroviral-like-particles (RVLPs)
  exprimieren

Question 3

Wie groß sind Viren?

Answer 3

• 20-100 nm (gibt auch kleinere z.B. Bakteriophage ~ 10 nm)
• mAb im Vergleich: ~8-10 nm (150 kDa) → wenn Bakteriophagen in Zellkultur enthalten sind,
  dann wird Virusfiltration kritisch (denn mind. so groß, dass mAb durchgelangen … wenn Viren ähnlich groß wie Produkt, dann gibt es ein Problem)

Question 4

Wo liegt der isoelektrische Punkt von Viren?

Answer 4

Im pH Bereich von 1,9 bis 8,4 (mAbs im Vergleich bei pl~7,5-9)

Question 5

Was spielt die Hülle bei Viren für eigene Rolle auf Größe und Widerstandsfähigkeit?

Answer 5

• nicht umhüllte Viren: klein, widerstandsfähig

* umhüllte Viren: groß, leicht zu beschädigen/inaktivieren durch z.B. PH, -> weniger widerstandsfähig

Question 6

Was bedeutet orthogonale Fahrweise bei der virenentfernung?

Answer 6

Aktuelle regulatorische Erwartungen für die Entwicklung eines Herstellungsprozesses
- Einbau von mindestens zwei orthogonalen Schritten zum Entfernen oder Inaktivieren von
Viren
o Inaktivierung meist in Prozess eingebaut → einfachste und wirtschaftlichste
Umsetzung (aber hauptsächlich nur bei umhüllten Viren wirksam)
- Orthogonale Fahreweise
o Abreicherung über unterschiedliche Methoden, also z.B. nicht zweimal
Größenfiltration hintereinander oder zweimal pH-variieren und abreichern → wäre
immer noch selber „Mechanismus/Methode“, also nicht orthogonal

Question 7

Was haben natürlich auftretende Materialien für einen Einfluss auf die virenbelastung?

Answer 7

Entfernung und Abreicherung von natürlich auftretenden Materialien (z.B. aus Tieren gewonnenes Material) → signifikante Reduzierung der zufällig auftretenden Virenkontamination

Question 8

Was ist bei scale-down Modellen in Bezug auf die Viren Entfernung zu beachten?

Answer 8

Der Scale-Down-Prozess, der innerhalb der Virus-Clearance-Studie verwendet wird, muss nachgewiesen werden, um die die Abreicherung so nah wie möglich für den großen Maßstab ( Produktionsmaßstab) zu gestalten!
- Beispielsweise muss der Druckabfall durch eine Virenfiltration im Scale-Down-Modell
vergleichbar nachgestellt werden, um die Auswirkungen analysieren/charakterisieren zu können

Question 9

Welche Parameter sind beim scale down für die Viren Entfernung zu beachten?

Answer 9

Beim scale-down sind scale-abhängige und unabhängige Parameter zu beachten:
-scale abhängige Parameter:
•werden so angepasst, dass sie für skalenunterschiede wie die gefäßgeometrie geeignet sind sodass prozessprofile mit denen im großem Maßstab vergleichbar sind
•rühr-und gasübertragungsraten sind skalierabhängige variablen, die ausgewertet werden müssen, um vergleichbare Misch -und stoffübergänge zu ermöglichen
- scale unabhängige Variablen
•Temperatur und pH wert können in der Regel mit denen im großen Maßstab ohne extra Korrektur abgeglichen werden

Question 10

Was sagt der log-reduktionsfaktor aus?

Answer 10

Bei der Bewertung der virenreduktion für einen bestimmten prozessschritt ist die Reduktion der Unterschied zwischen der mit Viren gespickten Load-sample der Gesamtmenge an Virus in der Virus clearance. Eliminierung des Zielvorgaben durch Entfernung von virenpartikeln oder Inaktivierung der viralen infektiosität.

Question 11

was ist eine Risikobewertung ?

Answer 11

Ein systematischer Prozess der Informationsorganisation zur Unterstützung einer Entscheidung, die im Rahmen eines Risikomanagementprozesses zu treffen ist. Es besteht aus der Ermittlung der Gefahren und der Analyse und Bewertung der damit verbundenen Risiken.

Question 12

Was ist ein relevanter Virus?

Answer 12

Virus in der Prozess-Evaluierungs Studie, das entweder der identifizierte Virus ist oder der gleichen Spezies angehört (siehe auch spezifischer Modellvirus) wie das bekannte Virus und voraussichtlich zur Verunreinigung/Kontamination des Zellsubstrats oder anderer Reagenzien oder Materialien führt

Question 13

Was ist ein spezifischer modellvirus?

Answer 13

Virus, das eng mit dem bekannten oder vermuteten Virus verwandt ist (gleiche Gattung oder Familie ), mit ähnlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften

Question 14

Was sagt die Prozess-Robustheit aus?

Answer 14

Die Fähigkeit eines Prozesses, die Variabilität der Materialien zu tolerieren und Änderungen an Prozess und Ausrüstung ohne negative Auswirkungen auf die Qualität zu gewährleisten

Question 15

Was ist ein nicht spezifischer modellvirus?

Answer 15

Ein Virus der zur Charakterisierung der viralen Clearance des Prozesses genutzt wird
▪ z.B. Kapazität der Herstellungsverfahren zur Beseitigung und/oder Inaktivierung von Viren
im Allgemeinen

Question 16

Wie werden risikobewertung gemacht?

Answer 16

Ein wichtiger Aspekt der Risikominderung ist die Durchführung „viraler Clearance spiking Studien“ (d. h. Studien, in denen Prozesslösung mit Viren „gespickt“/versetzt ist) für mehrere nachgeschaltete Reinigungsschritte zum Nachweis der Kapazität und Fähigkeit des Prozesses, bekannte und unbekannte Viren zu entfernen und/oder zu inaktivieren → Prozess-Robustheit wird dadurch analysiert

Question 17

Merkmale für die regulatorische Erwartungen für virenabgleichsstudien?

Answer 17

• Virus-Clearance-Studien beurteilen die Fähigkeit des Downstream Aufreinigungsprozesses
  relevante Viren abzureichern - Im Gegensatz zur bakteriellen Sterilisation, bei der ein Indikatororganismus angegeben ist,
  gibt es kein universelles Indikatorvirus, das in Virus-Clearance-Studien verwendet werden
  kann
  o Reihe von Viren wird verwendet
• Ziel von Virus-Clearance-Studien: (… siehe oben) - zusätzliche Überlegungen zur Auswahl von Modellviren für die Virus- Clearance -Studien
  o Titer in denen Viren wachsen können o Anwesenheit eines zuverlässigen Tests für den Nachweis von Viren o gesundheitlichen Gefahren, die die Viren für das durchführende Personal darstellen
  können

Question 18

Was muss bei der Durchführung von virenabgleichsstudien zu beachten?

Answer 18

• In der Investigation-New Drug Application (IND) Einreichungsphase sind virale Clearance-
  Studie mit mindestens zwei Modellviren durchzuführen
  o typischerweise wird ein Modell-Retrovirus (X-MuLV) und ein Parvovirus (MMV)
• Im Rahmen der kommerziellen Lizenzierung ist es üblich, die Virus - Clearance - Studien
  mehrfach durchzuführen
  o mit mindestens drei bis fünf Modellviren
• Zusätzlich ist es notwendig, den Clearance-Mechanismus für die viralen Clearance-Schritte
  einzurichten
  o Beispielsweise im Fall von Chromatographieschritten - Massenbilanz festlegen;
  Beladungs-, Elutions-, Durchlauf-, Wasch-, und Regenerationsproben werden
  ebenfalls analysiert, um zu bestimmen, wo das Virus dazu neigt, zu eluieren
• Abreicherung von weniger als 1 log10-Stufe sind in Zusammenstellung der Gesamt-log-
  Abreicherung für Prozess i.d.R. nicht enthalten

Question 19

Was ist die risikobwertung?

Answer 19

Grundpfeiler zur Gewährleistung der Virussicherheit für biotechnologischen Erzeugnisse

Question 20

Welche drei Ansätze gibt es um mögliche Kontaminationen von biotech. Produkten zu verhindern?

Answer 20

Drei komplementäre Ansätze:
o Selektieren von und Testen von Zelllinien und anderen Rohstoffen, einschließlich
Zellkultur-Medium, auf Abwesenheit von Viren o Virus-Clearance-Studien (Virus-Spiking-Studien oder virale Clearance-Validierung
Studien), die die Fähigkeit des Downstream-Prozesses, Viren abzureichen, evaluieren o Prüfung des Produkts in geeigneten Stadien der Produktion auf Abwesenheit
verunreinigender Viren
Merke: nicht ganzen Downstream-Prozess aufbauen und analysieren, sondern nur
kritischen Schritte (z.B. Virusfiltration, …)

Question 21

Eine häufig gestellte Frage ist, ob eine bestimmte Anzahl von log-Stufen der Clearance
ausreicht, um Produkt in klinische Phase zu bringen?

Answer 21

o die Antwort ist, dass es keine feste Leitlinie gibt o dennoch ist ein Ziel, das typischerweise in der biopharmazeutischen Industrie
angewendet wird, mindestens 4-6 log-Stufen für die Clearance eines Modell-
Retrovirus zu erreichen
→ d.h. dass höchstens eine von 104-106 Dosen virale Partikel enthalten darf

Question 22

Was ist das hanging drop Problem?

Answer 22

• Flüssigkeitstropfen an den Wänden oder am Dach des Gefäßes können den niedrigen pH-
  Zustand nicht erreichen → ist aber gefordert dass gleichmäßiges Inaktivieren (also über niedriger pH)
• Lösung
  o Produktzwischenprodukt nach dem pH-Wert Absenken in ein anderes Gefäß pumpen → dadurch überall niedriger pH

Question 23

Was kann für die virusinaktivierung genutzt werden wenn das Produkt pH sensibel ist?

Answer 23

Inaktivierung durch „Solvent detergent“ oder „detergent“ allein (Lösungsmittel oder Reinigungsmittel) Für Produkte, die niedrigen pH-Bedingungen nicht aushalten → oft Lösungsmittel/Detergens oder Detergens alleine als chemisches Mittel zur Inaktivierung umhüllter
- Das Detergens unterbricht die Lipidstruktur der Virushülle… Effekt wird durch Lösungsmittel
noch verstärkt → Störung der Lipidhülle macht das Virus unfähig zur Infektion

Question 24

Was muss nach der chemischen Inaktivierung beachtet werden?

Answer 24

Nach der chemischen Inaktivierung müssen für Inaktivierungsschritt eingesetzte Mittel beseitigt werden
- Deshalb liegt dieser Schritt in der Anfangsphase des Downstream-Prozesses
o Mehrere Chromatograpie- und Filtrationsschritte ermöglichen Beseitigung des
Inaktivierungsmittels
- Restmengen an Detergenz können trotzdem an Produkt gebunden bleiben - Typischerweise wird Restassay typischerweise auf Arzneimittelsubstanz durchgeführt, um
dies zu beurteilen

Question 25

Welchen Einfluss können Lösemittel und detergenz auf eine chromatographie haben?

Answer 25

Es besteht die Möglichkeit, dass Lösungsmittel und Detergenz die Leistungsfähigkeit eines Chromatographieschrittes, insbesondere eines, das unmittelbar der Inaktivierung folgt, stört/beeinflusstkönnte manifestieren

Question 26

Welche chromatographieapperate sind am resistentesten gegen interferenz/Störung durch detergenzien?

Answer 26

o Ionenaustausch- und Affinitätschrom. o Protein-A-Chromatographie (Lösungsmittel-Detergens kann hier vorangeschalten
werden)
→ hydrophobe Resins sollten vermiden werden (HIC also schlecht direkt nach Virus- Inaktivierung mit Detergenzien)

Question 27

Welche Methoden gibt es zur Inaktivierung von Viren?

Answer 27

• niedriger pH wert
• Gamma Bestrahlung
• Hochtemperatur-kurzzeitig Behandlung
• UV Strahlung
• chromatographieschritte
• anionenaustauschchromatographue
• kationenaustauschchrom/HIC
• virusabreicherungs Filtration

Question 28

Wo wird Hochtemperatur kurzzeit Behandlung eingesetzt?

Answer 28

• Verhinderung viraler Verunreinigungen in Bioreaktoren
• Inaktivierung von ≥ 3 log10-Stufen (bei 5 % des Mediums spiked mit Viren, behandelt für 60 s
  bei 100 °C)

Question 29

Wie wird UV Strahlung eingesetzt?

Answer 29

• Verwendet mit Bench-Scale-System, das einen helikalen Reaktor mit maximaler Wellenlänge
  von 254 nm verwendet
  o Dieses System liefert eine einheitliche Behandlung der Materialien und können für
  eine gleichmäßige Exposition der erforderlichen Dosierung kontrolliert werden
• Inaktivierung von ≥ 6 log10-Stufen möglich

Question 30

Wo wird Gamma Bestrahlung z.B. Eingesetzt?

Answer 30

Wird für Risikominderungsstrategie für Rohstoffe verwendet wie z.B. Rinderserumalbumin (
BSA)

Question 31

Merkmale bei der Inaktivierung durch chromatographieschritte?

Answer 31

Es wurde gezeigt, dass die meisten viralen Partikel durch Protein A-Säulen ohne Bindung fließen
- Protein A Chrmatographie kann routinemäßig 4-5 log10-Stufen retroviraler Beseitigung liefern
o Aber: signifikante Variabilität bei verschiedenen Produkten
Anzahl der log-Stufen der viralen Clearance bei Chromatographie-Schritten ist in hohem Maße von dem Virustiter und den spike % (Merke: spike heißt zugesetzte Viren für Clearance Studien) des Ladungsmaterials abhängig
- Für Stufen, die in der Lage sind, eine gute Clearance zu schaffen ist eine hoher Titer-Spike (d.
h. hohe Menge an Viren für Untersuchung der Abreicherung im „Load“) im Load günstig für Anstieg der Anzahl der LRVs

Question 32

Wichtiges bei der Inaktivierung von Viren mittels anionanaustauschchroatographie?

Answer 32

• > 4 LRV
• LRV bei dieser Art der Chromatographie stark von abhängig der Leitfähigkeit des „Load“
  o höheren Leitfähigkeiten → geringere Clearance, da Viruspartikel beginnen aus Säule
  zu eluieren - Ergebnis
  o Anionenaustauschchrom als Virus-Clearance-Schritt, insbesondere für mAbs, die
  typischerweise basisch sind und durch Anionenaustauschsäulen fließen können

Question 33

In welchem Bereich liegt der LRV bei einem kationenauschchrom. Und HIC?

Answer 33

1-3 LRV

Question 34

Was ist bei der virenentfernung durch virusabreicherung-filtration zu beachten?

Answer 34

Eine geeignete Vorfiltrationsstrategie muss entwickelt werden, um Virus-Reduktionsfilter vor Verstopfung zu schützen
- z.B. einfacher Größenausschlussfilter (0,22 oder 0,10 μm-Filter)
- oder Entfernung von Verunreinigungen von den Absorptionseigenschaften der Filtermatrix
Merke:
- kleinen Porenfiltern (20 nm Größe) → für Viren, die über 20 nm groß sind und ohne viralen
Durchbruch ist 5-6 LVP erreichbar
für kleine Viren, wie Parvovirus, etwa 4 LVP (da Durchbrüche auftreten könne

Question 35

Inaktivierung von Viren mittels pH wert Senkung?

Answer 35

Niedrige pH-Bedingungen sind dafür bekannt, umhüllte Viren erfolgreich zu inaktivieren
- Besonders kompatibel mit Downstream-Prozess von mAbs
o Elution bei Protein A-Capture-Säulen typischerweise bei niedrigen pH-Werten o Sehr häufig folgt dieser niedrigen pH-Elution eine Inkubation bei niedrigem pH-Wert
zur Inaktivierung von Viren
- Im Allgemeinen werden virale Inaktivierungsschritte zwischen pH 3,0 und 4,0 durchgeführt
o erfolgreiche Virusinaktivierung erfordert einen pH-Wert von 3,8 oder niedriger - typische Zeitdauer
o bei pH 3,8 oder niedriger Virusinaktivierung oft innerhalb von 10-15 min
abgeschlossen (ist pH höher, dann oft bis zu einer Stunde oder mehr)
- Niedrige pH-Wert wird typischerweise durch Zugabe einer schwachen Säure zu der
Proteinlösung erreicht (z.B. verdünnte HCl oder höhere Konzentrationen von Zitronensäure
oder Essigsäure) - Höhere Konzentrationen einer starken Säure können lokal sehr niedrige pH-Werte in einem
großen Tank erzeugen → Aggregation der Proteine oder anderen Problemen, die
möglicherweise die Produktqualität beeinträchtigen
Schwache Basenlösungen werden typischerweise für die Neutralisation verwendet, nachdem der Inaktivierungsschritt abgeschlossen ist