Kapitel 8 - Virenabreicherung Flashcards
Wodurch können Kontaminationen auftreten?
- Kontaminationen der Zelllinie
- zufälliges Einbringen von Viren während der Produktion
Wodurch wird das Risiko für Zellkulturen möglicherweise hervorgerufen?
- zufällige Virenkontamination
o durch kontaminiertes Rohmaterial o oder bei Prozess eingebracht - Nager-Zelllinien (Mäuse, Hamster, …), die endogene retroviral-like-particles (RVLPs)
exprimieren
Wie groß sind Viren?
- 20-100 nm (gibt auch kleinere z.B. Bakteriophage ~ 10 nm)
- mAb im Vergleich: ~8-10 nm (150 kDa) → wenn Bakteriophagen in Zellkultur enthalten sind,
dann wird Virusfiltration kritisch (denn mind. so groß, dass mAb durchgelangen … wenn Viren ähnlich groß wie Produkt, dann gibt es ein Problem)
Wo liegt der isoelektrische Punkt von Viren?
Im pH Bereich von 1,9 bis 8,4 (mAbs im Vergleich bei pl~7,5-9)
Was spielt die Hülle bei Viren für eigene Rolle auf Größe und Widerstandsfähigkeit?
- nicht umhüllte Viren: klein, widerstandsfähig
* umhüllte Viren: groß, leicht zu beschädigen/inaktivieren durch z.B. PH, -> weniger widerstandsfähig
Was bedeutet orthogonale Fahrweise bei der virenentfernung?
Aktuelle regulatorische Erwartungen für die Entwicklung eines Herstellungsprozesses
- Einbau von mindestens zwei orthogonalen Schritten zum Entfernen oder Inaktivieren von
Viren
o Inaktivierung meist in Prozess eingebaut → einfachste und wirtschaftlichste
Umsetzung (aber hauptsächlich nur bei umhüllten Viren wirksam)
- Orthogonale Fahreweise
o Abreicherung über unterschiedliche Methoden, also z.B. nicht zweimal
Größenfiltration hintereinander oder zweimal pH-variieren und abreichern → wäre
immer noch selber „Mechanismus/Methode“, also nicht orthogonal
Was haben natürlich auftretende Materialien für einen Einfluss auf die virenbelastung?
Entfernung und Abreicherung von natürlich auftretenden Materialien (z.B. aus Tieren gewonnenes Material) → signifikante Reduzierung der zufällig auftretenden Virenkontamination
Was ist bei scale-down Modellen in Bezug auf die Viren Entfernung zu beachten?
Der Scale-Down-Prozess, der innerhalb der Virus-Clearance-Studie verwendet wird, muss nachgewiesen werden, um die die Abreicherung so nah wie möglich für den großen Maßstab ( Produktionsmaßstab) zu gestalten!
- Beispielsweise muss der Druckabfall durch eine Virenfiltration im Scale-Down-Modell
vergleichbar nachgestellt werden, um die Auswirkungen analysieren/charakterisieren zu können
Welche Parameter sind beim scale down für die Viren Entfernung zu beachten?
Beim scale-down sind scale-abhängige und unabhängige Parameter zu beachten:
-scale abhängige Parameter:
•werden so angepasst, dass sie für skalenunterschiede wie die gefäßgeometrie geeignet sind sodass prozessprofile mit denen im großem Maßstab vergleichbar sind
•rühr-und gasübertragungsraten sind skalierabhängige variablen, die ausgewertet werden müssen, um vergleichbare Misch -und stoffübergänge zu ermöglichen
- scale unabhängige Variablen
•Temperatur und pH wert können in der Regel mit denen im großen Maßstab ohne extra Korrektur abgeglichen werden
Was sagt der log-reduktionsfaktor aus?
Bei der Bewertung der virenreduktion für einen bestimmten prozessschritt ist die Reduktion der Unterschied zwischen der mit Viren gespickten Load-sample der Gesamtmenge an Virus in der Virus clearance. Eliminierung des Zielvorgaben durch Entfernung von virenpartikeln oder Inaktivierung der viralen infektiosität.
was ist eine Risikobewertung ?
Ein systematischer Prozess der Informationsorganisation zur Unterstützung einer Entscheidung, die im Rahmen eines Risikomanagementprozesses zu treffen ist. Es besteht aus der Ermittlung der Gefahren und der Analyse und Bewertung der damit verbundenen Risiken.
Was ist ein relevanter Virus?
Virus in der Prozess-Evaluierungs Studie, das entweder der identifizierte Virus ist oder der gleichen Spezies angehört (siehe auch spezifischer Modellvirus) wie das bekannte Virus und voraussichtlich zur Verunreinigung/Kontamination des Zellsubstrats oder anderer Reagenzien oder Materialien führt
Was ist ein spezifischer modellvirus?
Virus, das eng mit dem bekannten oder vermuteten Virus verwandt ist (gleiche Gattung oder Familie ), mit ähnlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften
Was sagt die Prozess-Robustheit aus?
Die Fähigkeit eines Prozesses, die Variabilität der Materialien zu tolerieren und Änderungen an Prozess und Ausrüstung ohne negative Auswirkungen auf die Qualität zu gewährleisten
Was ist ein nicht spezifischer modellvirus?
Ein Virus der zur Charakterisierung der viralen Clearance des Prozesses genutzt wird
▪ z.B. Kapazität der Herstellungsverfahren zur Beseitigung und/oder Inaktivierung von Viren
im Allgemeinen
Wie werden risikobewertung gemacht?
Ein wichtiger Aspekt der Risikominderung ist die Durchführung „viraler Clearance spiking Studien“ (d. h. Studien, in denen Prozesslösung mit Viren „gespickt“/versetzt ist) für mehrere nachgeschaltete Reinigungsschritte zum Nachweis der Kapazität und Fähigkeit des Prozesses, bekannte und unbekannte Viren zu entfernen und/oder zu inaktivieren → Prozess-Robustheit wird dadurch analysiert
Merkmale für die regulatorische Erwartungen für virenabgleichsstudien?
- Virus-Clearance-Studien beurteilen die Fähigkeit des Downstream Aufreinigungsprozesses
relevante Viren abzureichern - Im Gegensatz zur bakteriellen Sterilisation, bei der ein Indikatororganismus angegeben ist,
gibt es kein universelles Indikatorvirus, das in Virus-Clearance-Studien verwendet werden
kann
o Reihe von Viren wird verwendet - Ziel von Virus-Clearance-Studien: (… siehe oben) - zusätzliche Überlegungen zur Auswahl von Modellviren für die Virus- Clearance -Studien
o Titer in denen Viren wachsen können o Anwesenheit eines zuverlässigen Tests für den Nachweis von Viren o gesundheitlichen Gefahren, die die Viren für das durchführende Personal darstellen
können
Was muss bei der Durchführung von virenabgleichsstudien zu beachten?
- In der Investigation-New Drug Application (IND) Einreichungsphase sind virale Clearance-
Studie mit mindestens zwei Modellviren durchzuführen
o typischerweise wird ein Modell-Retrovirus (X-MuLV) und ein Parvovirus (MMV) - Im Rahmen der kommerziellen Lizenzierung ist es üblich, die Virus - Clearance - Studien
mehrfach durchzuführen
o mit mindestens drei bis fünf Modellviren - Zusätzlich ist es notwendig, den Clearance-Mechanismus für die viralen Clearance-Schritte
einzurichten
o Beispielsweise im Fall von Chromatographieschritten - Massenbilanz festlegen;
Beladungs-, Elutions-, Durchlauf-, Wasch-, und Regenerationsproben werden
ebenfalls analysiert, um zu bestimmen, wo das Virus dazu neigt, zu eluieren - Abreicherung von weniger als 1 log10-Stufe sind in Zusammenstellung der Gesamt-log-
Abreicherung für Prozess i.d.R. nicht enthalten
Was ist die risikobwertung?
Grundpfeiler zur Gewährleistung der Virussicherheit für biotechnologischen Erzeugnisse
Welche drei Ansätze gibt es um mögliche Kontaminationen von biotech. Produkten zu verhindern?
Drei komplementäre Ansätze:
o Selektieren von und Testen von Zelllinien und anderen Rohstoffen, einschließlich
Zellkultur-Medium, auf Abwesenheit von Viren o Virus-Clearance-Studien (Virus-Spiking-Studien oder virale Clearance-Validierung
Studien), die die Fähigkeit des Downstream-Prozesses, Viren abzureichen, evaluieren o Prüfung des Produkts in geeigneten Stadien der Produktion auf Abwesenheit
verunreinigender Viren
Merke: nicht ganzen Downstream-Prozess aufbauen und analysieren, sondern nur
kritischen Schritte (z.B. Virusfiltration, …)
Eine häufig gestellte Frage ist, ob eine bestimmte Anzahl von log-Stufen der Clearance
ausreicht, um Produkt in klinische Phase zu bringen?
o die Antwort ist, dass es keine feste Leitlinie gibt o dennoch ist ein Ziel, das typischerweise in der biopharmazeutischen Industrie
angewendet wird, mindestens 4-6 log-Stufen für die Clearance eines Modell-
Retrovirus zu erreichen
→ d.h. dass höchstens eine von 104-106 Dosen virale Partikel enthalten darf
Was ist das hanging drop Problem?
- Flüssigkeitstropfen an den Wänden oder am Dach des Gefäßes können den niedrigen pH-
Zustand nicht erreichen → ist aber gefordert dass gleichmäßiges Inaktivieren (also über niedriger pH) - Lösung
o Produktzwischenprodukt nach dem pH-Wert Absenken in ein anderes Gefäß pumpen → dadurch überall niedriger pH
Was kann für die virusinaktivierung genutzt werden wenn das Produkt pH sensibel ist?
Inaktivierung durch „Solvent detergent“ oder „detergent“ allein (Lösungsmittel oder Reinigungsmittel) Für Produkte, die niedrigen pH-Bedingungen nicht aushalten → oft Lösungsmittel/Detergens oder Detergens alleine als chemisches Mittel zur Inaktivierung umhüllter
- Das Detergens unterbricht die Lipidstruktur der Virushülle… Effekt wird durch Lösungsmittel
noch verstärkt → Störung der Lipidhülle macht das Virus unfähig zur Infektion
Was muss nach der chemischen Inaktivierung beachtet werden?
Nach der chemischen Inaktivierung müssen für Inaktivierungsschritt eingesetzte Mittel beseitigt werden
- Deshalb liegt dieser Schritt in der Anfangsphase des Downstream-Prozesses
o Mehrere Chromatograpie- und Filtrationsschritte ermöglichen Beseitigung des
Inaktivierungsmittels
- Restmengen an Detergenz können trotzdem an Produkt gebunden bleiben - Typischerweise wird Restassay typischerweise auf Arzneimittelsubstanz durchgeführt, um
dies zu beurteilen
