Kapitel 5 - aggregation bei mAbs Flashcards
Was sind aggregate?
Aggregat=Proteinspezies mit höherem Molekulargewicht (Kovalente Bindungen und nicht-
kovalente Interaktionen)
Nach was können aggregate eingeteilt werden?
o Bindung:
nicht-kovalente Aggregate (schwache elektrostatische Kräfte)
kovalente Aggregate (z.B. Disulfidbrücken) o Reversibilität: Reversible vs. Irreversible Aggregate o Größe:
Kleine lösliche Aggregate (Oligomere wie z.B. Dimere, Trimere,…)
Große Aggregate (10-mer Oligomere)
Aggregate mit Durchmesser 20nm -1µm
Unlösliche Aggregate mit Durchmesser 1-25µm
Große unlösliche Aggregate im sichtbaren Bereich o Proteinkonformation:
Aggregate mit überwiegend nativer Struktur
Aggregate mit überwiegens nicht-nativer Struktur (dh. Teilweise entfaltet oder
fibrilläre Aggregate)
Faktoren die zur aggregation führen können?
Temperatur, pH, Sauerstoff, Scherkräfte, Ionenstärke, Anwesenheit bestimmter Liganden,
Stress: Einfrieren, Kontakt mit Luft oder Interaktion mit Metalloberfläche kann zu Veränderungen der Struktur bis hin zur Entfaltung führen
Wie entstehen aggregate während der Zellkultur?
- Aggregation Level während Zellkultur bis zu 30% (in Säugetierzellkulturen)
- Aggregate werden:
o Innerhalb der Zelle gebildet, nach der Proteinexpression o Außerhalb der Zelle im Zellkulturmedium, wenn das Protein sekretiert wurde - Verhinderung der Aggregation:
o Verwendung der optimalen Zelllinie o Optimierung der Zellkulturbedingungen - Freie Thiolgruppen unterstützt die Bildung von Aggregaten
→ Durch die Zugabe von CuSO4nahm die Anzahl an freien Thiolgruppen ab
→ Durch die Zugabe von Cu2+ (Oxidationsmittel) wurde ebenfalls die Bildung von
Disulfidbrücken unterstützt
Wie kann es zur aggregation während der aufreinigung kommen?
- bei Temperatur erhöhen
- bei Proteinkonzentration Erhöhung
-bei Senkung von pH wert
-pH Werte nahe dem isoelektrischen Punkt
-nach der Neutralisation - puffereigenschaften
Durch Ultra/diafiltration - agitation
(Bewegung)
-Pumpen
Wie kann die Erhöhung der Temperatur Auswirkungen auf die aggregation haben?
o Beschleunigung von chemischen Reaktionen (wie Oxidation und Desamidierung) →
kann zu Aggregation führen
o Direkte Wirkung auf die Konformation von Polypeptidketten (Quartär-, Tertiär- und
Sekundärstruktur) →Entfaltung kann zu Aggregation führen
o Die Schmelztemperatur (Tm) ist ein Maß für die thermische Stabilität (Temperatur,
bei der 50% der Proteine entfaltet sind); liegt meist zwischen 40 und 80°C
→Biopharmazeutika deutlich unter der Tm Fermentieren und Aufreinigen; meist bei 2
-8°C
Wie kann die Erhöhung der proteinkonzentration Auswirkungen auf die aggregation haben?
o Begünstigung der Aggregatbildung bei ruhender Lagerung
o Verdrängung durch Makromoleküle tritt auf → Makromoleküle organisieren sich
selbst und somit ist potentiell Aggregatbildung möglich; aber gleichzeitig wird
Entfalten von Molek. verhindert, was die Voraussetzung für viele
Aggregationsreaktionen ist →Aufkonzentrieren zur Aggregatverhinderung
o Verringerung des verfügbaren Volumens kann zu Aggregation führen
Wie kann die Verringerung des Ph Werts Auswirkungen auf die aggregation haben?
o bei niedrigem pH (wie bei Protein A-Chroma) können Proteine ihre Struktur ändern→
kann zu Aggregation führen (pH 3,2: 25% aggregierendes mAb)
→Minimieren der Aggregatbildung bei der Chromatographie:
Verwendung von Harnstoff (chaotrop) bei moderaten Konzentrationen (<2M) als
Stabilisator oder zur Auftrennung bei niedrigen Temperaturen
o niedriger pH auch bei Virus Inaktivierung
o Neutralisationsschritt nach Virusinaktivierung zur Stabilisierung des Produkts
ABER: Neutralisation mit starken Basen (Natriumhydroxid) wird vermieden (obwohl
als Vorteil nur wenig Volumen hinzugegeben werden würde), da im Bereich in dem
die Base zugegeben wird das Produkt denaturieren könnte
Darum Verwendung von schwacheren Basen (Tris base solution)
Wie kann ein pH wert nahe am isoelektrischen Punkt Auswirkungen auf die aggregation haben?
o pI: die Nettoladung eines Proteins ist vom pH abhängig. Am isoelektrischen punkt
beträgt die Nettoladung null. o Nahe dem pI enthält Protein sowohl positive als auch negativ geladene Gruppen →
Protein-Protein-Interaktionen werden begünstigt → Aggregation energetisch günstig
Wie könne puffereigenschaften Auswirkungen auf die aggregation haben?
o Typ und Konzentration des Salzes sind ausschlaggebend (Hofmeister Reihe)
▪ Organische Säuren oder Basen sind Chaotrop, Schwächung hydrophober
Effekte → Destabilisieren (Denaturieren Proteine) ▪ Kleine stark geladene Ionen sind Antichaotrop → Stabilisieren (Fällung)
Chaotrope Salze: schwächen hydrophobe Interaktionen und destabilisieren → Verhindern Aggregation Kosmotrophe Salze: stabilisieren
o Zugabe von Tensiden (z.B. Polysorbate) werden häufig zu Proteinlösungen
hinzugegeben → Verhindern der bewegungsinduzierten Aggregation (verhindern hydrophobe Interaktionen an der Gas/Flüssig Grenze)
o Typ und Konzentration des Salzes sind ausschlaggebend (Hofmeister Reihe)
▪ Organische Säuren oder Basen sind Chaotrop, Schwächung hydrophober
Effekte → Destabilisieren (Denaturieren Proteine) ▪ Kleine stark geladene Ionen sind Antichaotrop → Stabilisieren (Fällung)
Chaotrope Salze: schwächen hydrophobe Interaktionen und destabilisieren → Verhindern Aggregation Kosmotrophe Salze: stabilisieren
o Zugabe von Tensiden (z.B. Polysorbate) werden häufig zu Proteinlösungen
hinzugegeben → Verhindern der bewegungsinduzierten Aggregation (verhindern hydrophobe Interaktionen an der Gas/Flüssig Grenze)
Wie kann die ultra/ diafiltration Auswirkungen auf die aggregation haben?
o Während dem UF Prozess: physical stress
▪ Pumpvorgang (mind. 50 Durchläufe) ▪ Protein wird gegen die Membran gedrückt (An der Membran höhere
Konzentration) →Membranfouling und Polarisation an der
Membrangrenzfläche
→Begünstigt Aggregation
Wie kann agitation (Bewegung) Auswirkungen auf die aggregation haben?
Agitation (Bewegung) → Erhalten der Homogenität
o Agitation kann zu Scherstress führen →mehrere Studien belegen, dass Scherung
alleine keine Proteinaggregation auslöst o ABER Agitation kann Kavitation verursachen
Kavitation: schnelle Bildung von Blasen in einer Flüssigkeit, die schnell
zusammenbrechen und eine Schockwelle und turbulente Strömungsbedingungen,
hohen Druck und extreme Temperaturen auslösen. → Hydroxyl- und
Wasserstoffradikale entstehen → begünstigt Proteinaggregation
Wie können Pumpen Auswirkung auf die aggregation haben?
o Bei Chromatographie Schritten, Virenfiltration, UF und beim Befüllen am Ende o Dadurch entstehen Scherkräfte und Kavitation → kann zu Aggregation führen
→ mehrere Studien belegen, dass Scherung während des Pumpens weniger für
Aggregatbildung verantwortlich ist o Aggregatbildung wird viel mehr durch gas/flüssig Phasengrenzen und dadurch
Kontakt mit festen Oberflächen, Verunreinigungen durch Partikel oder Kavitation
durch Pumpen verurusacht o Final Filling und Einfrieren, Auftauen und Lagerung
Wichtige Merkmale der aggregatanalyse.?
Ziel, Probleme, Lösungen
- Zur Quantifizierung, Größeneinschätzung und Charakterisierung
- ABER: unterschiedliche Messmethoden können zu Inkonsistenz in Parametern (Mittlere
Größe, Größenverteilung, Menge eines Aggregattyps) führen - Bis jetzt gibt es keine Messmethode, die den gesamten Größenbereich, in dem Aggregate
auftauchen können, abdeckt (nm-Bereich bis 100µm-Bereich) - Messmethoden müssen Leistung und Limitierung geprüft werden
o Spezifische Nachweisgrenze der Detektion o Die Möglichkeit „artefacts“ (z.B. Aggregatbildung Induzieren oder Zerstören)
während der Probenvorbereitung zu bilden →evlt. Verschiebung des
AggregationsGGW oder Verlust von Aggregaten durch Adsorption (an Säulenmaterial
oder Membran) - Verwendung von orthogonalen Methoden und vergleich der Ergebnisse Orthogonale Methoden: Verwendung oder Kombination einer Vielzahl von verschiedenen analytischen Methoden die unterschiedliche Messmethoden aufweisen (Größe, Menge oder Struktur)
Welche Techniken gibt es zur aggregatsanalyse?
o Quantifizierung und/oder Größenschätzung: SE-HPLC, RP-HPLC, SDS-Page, UV-Vis-
Spektroskopie, Analytische Ultrazentrifugation, static and dynamic light scattering →
im Bereich von 10-100nm o Charakterisierung: Fluoreszenz-Spektroskopie, Infrarot (IR) Spektroskopie
