Kapitel 7 - chromatographie Flashcards
Fakten zur affinitätschromatographie?
Aufgrund hoher Selektivität, hoher Flussrate, kosteneffektiven Bindungskapazität und
Kapazität für weitestgehend Beseitigung prozessbedingter Verunreinigungen
o Z.B. 2-3 log-Stufen Abreicherung von HCP
o Elutions pH-Wert > 3,0
o Rückgewinnung (Recovery) > 85 %
o Lebenszeit > 200 Zyklen
Wie reagiert Protein A mit dem Fc-komplex?
Protein A bindet an die Fc-Region von IgG um das Gelenk zwischen der CH2- und CH3-
Domänen ▪ Es enthält fünf hochhomologe Fc-Bindungsdomänen und kann mindestens zwei IgG-
Moleküle gleichzeitig binden (Merke: nur eines meiner 5 Segmente der FC-Region bindenden
Sequenzen bindet an die Fc-Region des Antikörpers… nicht alle auf einmal)
Merkmale der F.C. Region, die an Protein A bindet?
Fc-Region, die an Protein A bindet, kann auch eine Anzahl anderer Moleküle binden
o wird auch Konsens-Bindungsstelle (CBS) genannt.. CBS ist weitgehend
hydrophobDiese Merkmale zeigen die Bestattung von hydrophoben Resten als o Nach Delano et al., unterzieht die CBS eine beträchtliche Konformationsänderungen
bei der Bindung an Liganden
Wie ist der Aufbau einer Protein A Säule (Protein A Affinitätsresins)?
Moderne „Protein A sorbents“ basieren auf kontrolliertem porösem Glas sowie beschichtete, poröse mineralische Materialien gefüllt mit Polymergelen und anderen Trägern. Solche Materialien sind
starr genug, um eine Säule zu ermöglichen, die bei hohen Durchflussraten betrieben wird
→ für bessere Bindung des mAb an Protein A: Sacermoleküle (d.h. Abstandshalter einbauen) an „Stationärer Phase“ anheften, damit mAb besser an Prot. A binden kann (denn sonst zu starke sterische Hinderung durch feste Phase, auf der Prot. A sitzt)
Was ist entscheidend beim capture-Schritt (einfangen)?
entscheidend bei Capture-Schritt ist, mit welcher Bindungskapazität (dynamic binding capacity = DBC ) und mit welchem Durchfluss ich fahren kann → Zeit wird kürzer wenn beides hoch → getreu dem Motto: „viel hilft viel“
▪ Ionenaustauscher binden besser und Kosten ~ 1/10 weniger als Prot. A, aber trotzdem
Capture mit Prot. A
o Mit Prot. A bessere Selektivität und höhere Ausbeute/Rückgewinnung
o Isothermen (Langmuir) bei Affinitätschromatographie ziemlich steil (dh. bei geringer
Konz. schon hohe Beladung möglich)
Was ist der Trend beim Nutzen von affinitätschromatographie Anlagen?
Ich möchte eher Facility/Anlage ausnutzen anstatt Protein komplett zu verwenden
→ d.h. bei Elutionschrom. (Batch) wird bis zum Durchbruch gefahren (nicht wie zuvor, dass vor dem Durchbruch Injektion gestoppt wird) –> etwas Proteinverlust wird in Kauf genommen damit Anlage komplett ausgenutzt wird
Was ist beim beladen von affinitätschromatographie mit monolayern zu beachten?
Bilden sich sog. Monolayer bei der Bindung von mAb an Prot. A (d.h. ein mAb über Fc-Region an Prot. A und weitere mAb aufgereiht über Bindung der konsanten Region an variable Region des vorangehenden mAb)
▪ Mit steigender Konz. ansteigende DBC möglich
▪ Trotz dq/dc=0 (also theoretisch bei qmax) weiterer Anstieg der Beladung
Wie können HCP binden durch affinitätschromatographie (ungewünscht)?
Über Multilayer (unspezifische Bindung der HCP an verschiedene Antikörperstellen
▪ An hydrophobe Oberfläche der stat. Phase (an „Feststoffpartikel“)
▪ Als Rucksackprotein (d.h. an Fab-Region des mab)
Was ist beim benutzten einer neuen affinitätschromatographie Säule zu beachten im Bezug auf Liganden?
Verlust von Ligand (Prot. A) nach Anfangsyklen relativ hoch (vwobei immer noch im ng-
Bereich) weil viele ausgespült werden die z.B. schlecht an feste Phase gebunden sind
o Irgendwann ist Menge an Prot. A-Resin konstant
Woran kann es liegen, dass es bei der Elution zu zwei Peaks kommt?
- Entweder da gewünschtes Produkt + Unbekannte Spezies bindet oder
- weil verschiedene Proteine/Produkte gebunden sind
z.B. mAb einfach gebunden an Protein A oder mAb an zwei Protein A (über beide schwere Ketten des mAb) gebunden -> d.h. Einfach gebundene eiligeren schneller als zweifach gebundene
Was könnte möglicherweise kritisch sein bei der Bindung mit Protein a als ligand?
Kritisches Paper bezüglich Protein A als Ligand → Bindung an Prot. A führt zu Strukturänderung des mAb (darf nicht sein!!!) … falls das stimmt, dann sicherlich bald andere Resins für Capture-Schritt
