Kapitel 1 Übersicht

Question 1

Was sind im feedstock Prozess die Parameter des Bioreaktoren?

Answer 1

.ph wert
.ionenstärke
.zusatzstoffe (Salz, detergenzien,…)
.viskosität ( intra und extrazellulärrd Produkt)
.konzentration des Produkts (intra und extrazellulär)

Question 2

Was sind die Produktpiraterie bei einem feedstock Prozess?

Answer 2

.stabilitätsfenster:
-PH 
-ionenstärke
- co faktoren
-Salz Typ 
- konzentration von detergenzien
- organische Lösemittel
- anderes (Licht, Sauerstoff,...)
.physikalische und chemische Eigenschaften:
-ladungseigenschaften (isoelektrischer Punkt)
-molekulargewicht
-Post transnationale Modifikationen
- biospezifische affinität
- Produkt Ähnliche kontaminanten

Question 3

Was sind die Parameter für die Zelle bei Feedstock Prozessen?

Answer 3

.viability (überlebensfähigkeit)
.scherempfindlichkeit
.zellbruchstücke
.zelldichte
.zellstreuung/ hell Verteilung 
.intrazelluläres Produkt
.extrazelluläres produkt

Question 4

Nicht mechanische zelllyse Methoden?

Answer 4

.lyse
.trocknung
.chemischer aufschluss

Question 5

Mechanische zelllyse Methoden?

Answer 5

.feststoffscherung
.flüssig Scherung
.kavitiation

Question 6

Lyse zellaufschluss Möglichkeiten?

Answer 6

.enzymatisch (lysozyme, phagen, Antibiotika)
.chemisch ( detergenzien, Lösemittel, base)
. Physikalisch ( osmotischef Schock, gefrier-auftauen)

Question 7

Wie kann für zelllyse feststoff Scherung genutzt werden?

Answer 7

.mahlen/ reiben
.aufprall
Bsp. Vibrationsmuster, kugelmühle, Hughes press

Question 8

Wie wird flüssig Scherung bei der zelllyse verwendet?

Answer 8

.ultraschall

.turbulenzen/ verwirbelung

Question 9

Wie wird kavitation bei der zelllyse verwendet?

Answer 9

.gas ausdehnung
.french press
.hochdruckhomogenisator

Question 10

Wie kann chemischer Aufschluss bei der zelllyse passieren?

Answer 10

.komplexbildende Verbindungen
.tenside
.chaotrophe Stoffe
.lösemittel
.synergieeffekte

Question 11

Wie wirken komplexbildente Verbindungen beim zellaufschluss?

Answer 11

Die äußere Membran von Gramnegativen Bakterien enthält LPS. Zweiwertige Kationen in der Membran Bilden Vernetzungen (Cross-linking) mit LPS aus und stabilisieren die Membran. Methode: EDTA als Chelatbildner kann Kationen binden → LPS wird freigesetzt → Die Membran wird permeabel → Zunahme der Permeabilität durch Phosphorlipide in der Membran, die versuchen die „Löcher“ zu füllen ABER: Methode setzt meist nur zytoplasmatische Proteine und nur im geringen Maß intrazelluläre Proteine frei

Question 12

Wie wirken Tenside beim chemischen zellaufschluss?

Answer 12

Aufbau: hydrophober (oft Kohlenwasserstoffe) und hydrophiler (oft ionisch) Teil Methode: Tenside können Lipide lösen → Aufbruch der Zellwand (Innere Membran Gramnegativer Bakterien
Kritische Mizellenbildungskonzentration: Konzentration eines Tensids, bei der sich Mizellen bilden ABER: Tenside können nur die innere Membran der Zellwand angreifen, da die äußere Membran eine Barriere gegenüber Tensiden aufweist Beipiele: Natriumdodecylsulfat (SDS ), Natriumsulfonat Cetyltrimethylammonium (CTAB) , Triton X-100, Natrium Taurocholat

Question 13

Wie wirken chaotrope Stoffe beim chemischen zellaufschluss?

Answer 13

Methode: Diese Stoffe stören die Wasserstruktur, indem sie Wasserstoffbrückenbindungen stören. Diese Störung der Wasserstruktur hat auch Auswirkungen auf in Wasser gelöste Makromoleküle. → Hydrophobe Effekte werden verringert → Löslichmachen von Integralen Membranproteinen Beispiele: Guadinium Salze, Harnstoff

Question 14

Wie wirken Lösemittel beim chemischen zellaufschluss?

Answer 14

Methode: bestimmte Lösungsmittel (meist Toluol) werden an Zellwandlipien absorbiert →
Membran schwillt an und zerreist
Prozessparameter: Lösungsmitteltyp, Lösungsmittelkonzentration, Inkubationszeit

Question 15

Wie wirken synergieeffekte beim chemischen zellaufschluss?

Answer 15

Werden beobachtet, wenn chaotrope Salze zusammen mit anderen Chemikalien verwendet
werden wie z.B. GuadiniumHCL & Triton X-100, oder SDS & Triton X-100. SDS kann
anschließden mit Hilfe von Zeolith Adsorbern entfernt werden

Question 16

Was bewirken chaotrophe Salze?

Answer 16

Vermindern hydrophobe Effekte -> denaturierung

Bsp.SCN-

Question 17

Was bewirken antichaotrophe Salze?

Answer 17

Verstärken hydrophobe Effekte -> Fällung

Bsp. NH4+

Question 18

Wie ändert sich die viskosität abhängig von Prozess?

Answer 18

o Freisetzung von DNA → Viskosität des Homogenisats steigt o Die Viskosität des Prozessstroms kann verringert werden durch
i. Eine Erhöhung des Anzahl an Durchgängen während der Homogenisierung →
Scherbelastung steigt
→ ABER: Zu viele Durchgänge erzeugen sehr kleine Zelltrümmer, welche die Aufreinigungsschritte des Produkts (Fällung, Filtration, Chromatographie) erschweren
ii. Die Zugabe von Nukleasen wie z.B. Benzonase
→ wird in der Industrie angewendet; ABER: strenge Vorschriften bei der Zugabe von fremden biologischen Material →hohe Kosten
o Zwischen 10°C und 60°C sinkt die Viskosität stark ab mit steigender Temperatur → somit sollte der Prozess bei der höchstmöglichen Temperatur gefahren werden
- Eigenschaften des Feedstocks

Question 19

Wo ist die viskosität eine wichtige physikalische Größe?

Answer 19

vor allem bei der Optimierung von

Aufreinigungsschritten (Zellaufschluss, Klärung, Filtration und Chromatografie)

Question 20

Was für eine Rolle spielt die viskosität bei der zentrifugation?

Answer 20

Anhand vom Stockes Gesetz erkennt man den Einfluss der Viskosität bei der
Aufreinigung mit einer Zentrifuge → umgekehrtes Verhältnis von Viskosität und
Teilchenabsetzgeschwindigkeit von Zelltrümmern → Absetzen der Teilchen kann
durch Verringerung der Viskosität erhöht werden

Question 21

Was für eine Rolle spielt die viskosität bei der packen bei chromatographie?

Answer 21

Die Kritische Geschwindigkeit (ukrit) mit der die Säule durchströmt werden kann ist
umgekehrt proportional zur Viskosität Konstante k enthält den Partikelradius und Widerstandskraft

Question 22

Was für eine Rolle spielt die viskosität bei der membranfiltration?

Answer 22

Die Durchflussrate ist umgekehrt proportional zu Viskosität
Darcys Gesetz:
Filter Widerstand:

Question 23

Welche industriellen Aspekte sind bei der Ernte - zentrifugation wichtig?

Answer 23

• Proteinausbeute
  o Protein/Produktverlust aufgrund von Scherkräften o Proteinverlust durch Oxidation o Proteinverlust durch Kuchenflüssigkeit o Proteinverlust durch Zellanhaftung
• Centrate suspended solids (>Tiefenfiltration) o Durch harte Homogenisierung
  o Aufgrund von Scherkräften in der Zentrifuge o Zellviabilität (Lebensfähigkeit)
• Durchflussrate - Beschleunigungs Effizienz - Senkung der Viskosität

Question 24

Was sind die ersten Schritte bei der Rückgewinnung von therapeutischen Proteinen?

Answer 24

Zentrifugation in Verbindung mit Tiefenfiltration

Question 25

Welche zentrifugen Parameter gibt es?

Answer 25

• G-Kraft - Verweilzeit - Entladungsfrequenz - Zelldichte - Viabilität bei der Ernte

Question 26

Was ist der Sigma Faktor?

Answer 26

Sigma Faktor:
- Die äquivalente Klärfläche gibt an, wie viel Fläche für die Sedimentation durch Schwerkraft
nötig wäre, um die gleiche Kapazität wie eine Zentrifuge zu erreichen.

Question 27

Was ist wichtig beim scale up im Bezug auf die äquivalente kläfläche?

Answer 27

• Für das Scale-up von Zentrifugen wird das Sigma Konzept herangezogen
  → Ziel: Aufrechterhalten des Verhältnisses Q/Σ
  Q=durchflussrats

Question 28

Was sind die Schritte bei einer sedimentation? Sedimentationsverhalten?

Answer 28

1. Verdünnte Lösung: Partikel setzen sich unabhängig voneinander nach dem Stokes-Gesetz
   ab
2. Steigender Feststoffkonzentration: Sedimentationsrate der Partikel wird trotz fehlendem
   physikalischem Kontakt hydrodynamisch von benachbarten Partikeln beeinflusst 3. Agglomeration der Partikel ab gewisser Konzentration (wegen geringer elektrischer
   Abstoßung)
   führt zu Absetzung der Partikel unabhängig von der Größe (fördernd wirken hier
   Ausflällungs- und Flockungsmittel; Dispersionsmittel wirken entgegen)