Kapitel 1 Übersicht Flashcards
Was sind im feedstock Prozess die Parameter des Bioreaktoren?
.ph wert
.ionenstärke
.zusatzstoffe (Salz, detergenzien,…)
.viskosität ( intra und extrazellulärrd Produkt)
.konzentration des Produkts (intra und extrazellulär)
Was sind die Produktpiraterie bei einem feedstock Prozess?
.stabilitätsfenster: -PH -ionenstärke - co faktoren -Salz Typ - konzentration von detergenzien - organische Lösemittel - anderes (Licht, Sauerstoff,...) .physikalische und chemische Eigenschaften: -ladungseigenschaften (isoelektrischer Punkt) -molekulargewicht -Post transnationale Modifikationen - biospezifische affinität - Produkt Ähnliche kontaminanten
Was sind die Parameter für die Zelle bei Feedstock Prozessen?
.viability (überlebensfähigkeit) .scherempfindlichkeit .zellbruchstücke .zelldichte .zellstreuung/ hell Verteilung .intrazelluläres Produkt .extrazelluläres produkt
Nicht mechanische zelllyse Methoden?
.lyse
.trocknung
.chemischer aufschluss
Mechanische zelllyse Methoden?
.feststoffscherung
.flüssig Scherung
.kavitiation
Lyse zellaufschluss Möglichkeiten?
.enzymatisch (lysozyme, phagen, Antibiotika)
.chemisch ( detergenzien, Lösemittel, base)
. Physikalisch ( osmotischef Schock, gefrier-auftauen)
Wie kann für zelllyse feststoff Scherung genutzt werden?
.mahlen/ reiben
.aufprall
Bsp. Vibrationsmuster, kugelmühle, Hughes press
Wie wird flüssig Scherung bei der zelllyse verwendet?
.ultraschall
.turbulenzen/ verwirbelung
Wie wird kavitation bei der zelllyse verwendet?
.gas ausdehnung
.french press
.hochdruckhomogenisator
Wie kann chemischer Aufschluss bei der zelllyse passieren?
.komplexbildende Verbindungen .tenside .chaotrophe Stoffe .lösemittel .synergieeffekte
Wie wirken komplexbildente Verbindungen beim zellaufschluss?
Die äußere Membran von Gramnegativen Bakterien enthält LPS. Zweiwertige Kationen in der Membran Bilden Vernetzungen (Cross-linking) mit LPS aus und stabilisieren die Membran. Methode: EDTA als Chelatbildner kann Kationen binden → LPS wird freigesetzt → Die Membran wird permeabel → Zunahme der Permeabilität durch Phosphorlipide in der Membran, die versuchen die „Löcher“ zu füllen ABER: Methode setzt meist nur zytoplasmatische Proteine und nur im geringen Maß intrazelluläre Proteine frei
Wie wirken Tenside beim chemischen zellaufschluss?
Aufbau: hydrophober (oft Kohlenwasserstoffe) und hydrophiler (oft ionisch) Teil Methode: Tenside können Lipide lösen → Aufbruch der Zellwand (Innere Membran Gramnegativer Bakterien
Kritische Mizellenbildungskonzentration: Konzentration eines Tensids, bei der sich Mizellen bilden ABER: Tenside können nur die innere Membran der Zellwand angreifen, da die äußere Membran eine Barriere gegenüber Tensiden aufweist Beipiele: Natriumdodecylsulfat (SDS ), Natriumsulfonat Cetyltrimethylammonium (CTAB) , Triton X-100, Natrium Taurocholat
Wie wirken chaotrope Stoffe beim chemischen zellaufschluss?
Methode: Diese Stoffe stören die Wasserstruktur, indem sie Wasserstoffbrückenbindungen stören. Diese Störung der Wasserstruktur hat auch Auswirkungen auf in Wasser gelöste Makromoleküle. → Hydrophobe Effekte werden verringert → Löslichmachen von Integralen Membranproteinen Beispiele: Guadinium Salze, Harnstoff
Wie wirken Lösemittel beim chemischen zellaufschluss?
Methode: bestimmte Lösungsmittel (meist Toluol) werden an Zellwandlipien absorbiert →
Membran schwillt an und zerreist
Prozessparameter: Lösungsmitteltyp, Lösungsmittelkonzentration, Inkubationszeit
Wie wirken synergieeffekte beim chemischen zellaufschluss?
Werden beobachtet, wenn chaotrope Salze zusammen mit anderen Chemikalien verwendet
werden wie z.B. GuadiniumHCL & Triton X-100, oder SDS & Triton X-100. SDS kann
anschließden mit Hilfe von Zeolith Adsorbern entfernt werden
Was bewirken chaotrophe Salze?
Vermindern hydrophobe Effekte -> denaturierung
Bsp.SCN-
Was bewirken antichaotrophe Salze?
Verstärken hydrophobe Effekte -> Fällung
Bsp. NH4+
Wie ändert sich die viskosität abhängig von Prozess?
o Freisetzung von DNA → Viskosität des Homogenisats steigt o Die Viskosität des Prozessstroms kann verringert werden durch
i. Eine Erhöhung des Anzahl an Durchgängen während der Homogenisierung →
Scherbelastung steigt
→ ABER: Zu viele Durchgänge erzeugen sehr kleine Zelltrümmer, welche die Aufreinigungsschritte des Produkts (Fällung, Filtration, Chromatographie) erschweren
ii. Die Zugabe von Nukleasen wie z.B. Benzonase
→ wird in der Industrie angewendet; ABER: strenge Vorschriften bei der Zugabe von fremden biologischen Material →hohe Kosten
o Zwischen 10°C und 60°C sinkt die Viskosität stark ab mit steigender Temperatur → somit sollte der Prozess bei der höchstmöglichen Temperatur gefahren werden
- Eigenschaften des Feedstocks
Wo ist die viskosität eine wichtige physikalische Größe?
vor allem bei der Optimierung von
Aufreinigungsschritten (Zellaufschluss, Klärung, Filtration und Chromatografie)
Was für eine Rolle spielt die viskosität bei der zentrifugation?
Anhand vom Stockes Gesetz erkennt man den Einfluss der Viskosität bei der
Aufreinigung mit einer Zentrifuge → umgekehrtes Verhältnis von Viskosität und
Teilchenabsetzgeschwindigkeit von Zelltrümmern → Absetzen der Teilchen kann
durch Verringerung der Viskosität erhöht werden
Was für eine Rolle spielt die viskosität bei der packen bei chromatographie?
Die Kritische Geschwindigkeit (ukrit) mit der die Säule durchströmt werden kann ist
umgekehrt proportional zur Viskosität Konstante k enthält den Partikelradius und Widerstandskraft
Was für eine Rolle spielt die viskosität bei der membranfiltration?
Die Durchflussrate ist umgekehrt proportional zu Viskosität
Darcys Gesetz:
Filter Widerstand:
Welche industriellen Aspekte sind bei der Ernte - zentrifugation wichtig?
- Proteinausbeute
o Protein/Produktverlust aufgrund von Scherkräften o Proteinverlust durch Oxidation o Proteinverlust durch Kuchenflüssigkeit o Proteinverlust durch Zellanhaftung - Centrate suspended solids (>Tiefenfiltration) o Durch harte Homogenisierung
o Aufgrund von Scherkräften in der Zentrifuge o Zellviabilität (Lebensfähigkeit) - Durchflussrate - Beschleunigungs Effizienz - Senkung der Viskosität
Was sind die ersten Schritte bei der Rückgewinnung von therapeutischen Proteinen?
Zentrifugation in Verbindung mit Tiefenfiltration
Welche zentrifugen Parameter gibt es?
- G-Kraft - Verweilzeit - Entladungsfrequenz - Zelldichte - Viabilität bei der Ernte
Was ist der Sigma Faktor?
Sigma Faktor:
- Die äquivalente Klärfläche gibt an, wie viel Fläche für die Sedimentation durch Schwerkraft
nötig wäre, um die gleiche Kapazität wie eine Zentrifuge zu erreichen.
Was ist wichtig beim scale up im Bezug auf die äquivalente kläfläche?
- Für das Scale-up von Zentrifugen wird das Sigma Konzept herangezogen
→ Ziel: Aufrechterhalten des Verhältnisses Q/Σ
Q=durchflussrats
Was sind die Schritte bei einer sedimentation? Sedimentationsverhalten?
- Verdünnte Lösung: Partikel setzen sich unabhängig voneinander nach dem Stokes-Gesetz
ab - Steigender Feststoffkonzentration: Sedimentationsrate der Partikel wird trotz fehlendem
physikalischem Kontakt hydrodynamisch von benachbarten Partikeln beeinflusst 3. Agglomeration der Partikel ab gewisser Konzentration (wegen geringer elektrischer
Abstoßung)
führt zu Absetzung der Partikel unabhängig von der Größe (fördernd wirken hier
Ausflällungs- und Flockungsmittel; Dispersionsmittel wirken entgegen)
