Kapitel 4 - fest-flüssig-trennung Flashcards
Welchen Einfluss haben die Zelldichte und Zell viabilität (intakte Zellen)? Und was sind Parameter dafür?
- Wichtiger Faktor: die Menge an Feststoffpartikeln in der Anfangszellkultur (Zelldichte) bei der
Ernte und die Zellviabilität - Hohe Zelldichten und geringe Viabilität → große Menge an ganzen Zellen und
Zellbruchstücken sowie feste Verunreinigungen → aber auch: hohe Produkttiter - Parameter:
o Zellkulturparameter:
▪ Lebende Zellen: Viabilität: ▪ Tote Zellen:
o Prozessparameter:
▪ Kläreffizienz der Zentrifuge:
▪ Effizienz des Tiefenfilters:
Was ist bei der zentrifugation und Scherung von säugetierzelle zu beachten? Und warum werden diese prozesschritte durchgeführt?
- Erster Schritt des Downstreams: Entfernung von unlöslichen Komponenten (ganze Zellen,
Zellbruchstücke, Kolloide, andere Kontaminanten) → Tellerzentrifugation und danach Tiefenfiltration - Zentrifugation: Scherung möglichst gering halten, ansonsten entstehen sehr kleine Partikel (
Submikron Größe) die nicht durch die Zentrifuge entfernt werden können - Die kleinste auftrennbare Partikelgröße einer Zentrifuge hängt ab von:
o Zellkultur Eigenschaften o Flussrate o Geometrie der Zentrifuge o Drehzahl
→Unter 0,5-1µm können Zellbruchstücke mit einer Tellerzentrifuge nicht mehr abgetrennt
werden - Sigma Faktor: Σ beinhaltet die Drehzahl und die Geometrie (Q ist der Durchfluss)
Q/Σ ↓: die auftrennbare Partikelgröße sinkt (?)
Q/Σ ↑: die auftrennbare Partikelgröße steigt
Merkmale der Tiefenfiltration?
- Dicke, poröse Matrix aus Cellulosefasern mit anorganischen Filterhilfsstoffen → positive
Ladung - Auftrennung aufgrund von Größe und Adsorptibe Effekte (Ladung)
→unter 0,1µm Partikelgröße ist die Siebwirkung nicht mehr wirksam
→durch die Auftrennung durch Ladung können aber noch viel kleinere negativ geladene
Kontaminanten (z.B. DNA, und HCP) abgetrennt werden
Welches Verhältnis aus lebend und toten Zellen gibt die beste aufreinigungs Effizienz?
Hohe Viabilitäten und niedrige NVCD-Werte (tote Zellen) bei batch Versuchen ergaben die
beste Aufreinigungseffizienz und Produktqualität sowohl mit Zentrifugen als auch mit
Tiefenfiltern. - Grund: es können nur begrenzt Zelltrümmer und Feinstoffe entfernt werden - Folgerung: bei der Zellernte mehr als 50% Viabilität beim scale-up
Der Einfluss der Tiefenfiltation aud die Entfernung von HCP (host cell Proteins)?
Erinnerung: Bei Protein A-Chromatographie können beim eluieren mit saurem pH AK aggregieren und HCP ausfallen →Verstopfung des Sterilfilters oder Fouling der Protein A-Chromatographiesäule
Bei einem chromatographie von Protein a chromatographi wird was in welchem Bereich gemessen?
- Messung bei 280nm: Detektion der Proteine - Messung bei 410nm: Messung der Trübung
Was kann man bei der Tiefenfiltration hinzugeben (Interaktion) und was ist die Folge daraus?
- Zugabe von Salz →Hydrostatik nimmt zu, weniger bindet
- Zugabe von Alkohol → Einfluss auf Filter, weniger bindet
Wichtige Erkenntnisse für das arbeiten mit Tiefenfiltration?
- Die Entfernung von HCP vor der Protein A-Chromatographie verringert die Fällung während
der Elution mit niedrigem pH - Die Beladung des Tiefenfilters spielt eine Rolle bei der Wirksamkeit des Filters - Benutzung von zwei Tiefenfiltern wirksamer als eine reduzierte Beladung → Reduzierung der
Trübung da das durchgebrochene Material vom zweiten Filter aufgehalten wird
Der Einfluss von HCP auf die Trübung bei der Tiefenfiltration?
Was kann zusätzlich zu Trübung führen?
Trübung nimmt zu je mehr der Filter beladen wird (HCP brechen durch)
• Auch DNA und CHOP (Host Cell Protein im Eluat) kann zu Zelltrübung führen
-> Trübung nimmt zu je mehr der Filter beladen wird (CHOP und DNA brechen durch)
