Kapitel 14 - inclusion Bodies

Question 1

Was sind inclusion bodies?

Answer 1

• Inclusion bodies (IBs) sind feste, im Mikrometerbereich große Proteinpartikel (meist falsch
  gefaltet) , die im Cytoplasma des E. colis enthalten sind

Question 2

Größe und dicht von inclusion bodies?

Answer 2

• Größe: d=0,81-1,28µm (soll auch bis zu 20µm geben) - Dichte: ρ=1124 (ϒ-Interferon) – 1034 (Prochymosin)

Question 3

Was sind wichtige pharmazeutische Produkte, die in inclusion bodies produziert werden?

Answer 3

⮚ menschliches Insulin (bei Diabetes)
⮚ menschliche Wachstumsfaktoren (bei Wachstumsstörungen)
⮚ Interferon-ß-1b (bei Multiple Sklerose)
⮚ Interferon-α-2a (bei Hepatitis B und C)
⮚ Tissue Plasminogen Activator (bei Akutem Herzinfarkt)
⮚…

Question 4

Warum bilden sich inclusion bodies?

Answer 4

Bildung aufgrund der Aggregation von Proteinen oder wegen des Unvermögens die Proteine
richtig zu falten

Question 5

Was beeinflusst die Wahrscheinlichkeit ob inclusion bodies gebildet werden?

Answer 5

Wahrscheinlichkeit für die Bildung von Inclusion bodies ist bestimmt durch das
Zusammenspiel von
a) dem molekularen Aufbausystem der Zelle und
b) dem thermodynamischen Gleichgewicht, das die Aggregation der Polypeptide verursacht

Question 6

Gibt es eine universale Methode für die rückfaltung von IB?

Answer 6

keine universale Methode für die Rückfaltung eines Proteins → für jedes Protein muss eigener
Prozess entwickelt werden

Question 7

Was sind Vorraussetzungen für einen rückfaltungsprozess von IB?

Answer 7

⮚ größenunabhängig ⮚ leicht automatisierbar (→ schneller → höherer Durchsatz) ⮚ allgemein gültig für eine breite Bande an ähnlichen Proteinen (Muss nicht jedes Mal
neu erfunden werden)
⮚ für jede neue Gensequenz ⮚ wirtschaftlich (keine unnötige Verwerfung; …)

Question 8

Welche mögliche Methoden gibt es für dein rückfaltungsprozess von IB?

Answer 8

⮚ Verdünnung (Flash-Dilution; Pulsatile Dilution) ⮚ Dialyse (Ein-Schritt- oder schrittweise Dialyse) ⮚ Rückfaltung an Kolonne (Größenausschluss-, Aniontauscher-, Affinitäts-,
Chromatographie, HIC) ⮚ Mikrofluidikchips ⮚ Urease vermittelte Rückfaltung

Question 9

Was sind rückfaltungsunterstützende additive für rückfaltungsprozess von IB?

Answer 9

⮚ Chaotrope Salze (Urea, Guanidin Hydrochlorid) ⮚ Aminosäuren (Glycin, Arginin, Prolin) ⮚ Zucker und mehrwertige Alkohole (Saccharose, Polyethylenglykol, Sorbitol, Glycerol) ⮚ Andere (Sulfobetain, ersetzte Pyridine und pyrolls, mit Säure ersetzte
Aminocyclohexane)

Question 10

Was ist ein generelles Schema für einen IB Prozess?

Answer 10

.ecolie enthält inclusion bodie
.zellernte
.inclusion Bodie Freisetzung 
.trennung von IB und Zellstücken 
.IB waschen
.erhöhung der Löslichkeit der IB(solubilization)
.reduzieren der disulfidbrücken
.refolding der ungefilterten Proteine 
.reinigung der richtig gefalteten Proteine

Question 11

Mögliche Kontaminationen bei IB Prozess?

Answer 11

1. …aufgenommene Kontaminanten (andere Polypeptide [5%-50%], DNA, zellentwickelnde
   Komponenten, Phospholipide [0,5%-13%]) in die Inclusion bodies während der Synthese 2. …Kleben an den Inclusion bodies während der Zelllyse 3. …unlösliche Zellbruchstücke (Zelltrümmer), die zusammen mit den Inclusion bodies
   abgeerntet werden

Question 12

Aufreinigung von zelltrümmern?

Answer 12

• lösliche Komponenten: DNA, lösliche Zellproteine, Lipid-Membran-Vesikel → können durch
  Filtration oder Zentrifugation leicht abgetrennt werden - unlösliche Komponenten: Peptidoglycan, Zellwandproteine, Lipide → Abtrennung schwierig (
  Größe und Absetzgeschwindigkeit ähnlich)
  → Reinigung durch wiederholten mechanischen oder chemischen Zellaufbruch gefolgt von differentieller Zentrifugation

Question 13

Merkmale für differentiellen zentrifugen bei dem abtrennen von zellbruchstücken?

Answer 13

• Labor: low-speed Zentrifugation (differentielle Zentrifugation): Sedimentation der IB;
  Verbleib der Kontaminanten im Überstand - Prozess: differentielle Zentrifugation kaum umsetzbar, stattdessen Einsatz von Detergentien
  und chaotropen Salze
  → Letzteres aber bei richtiger Zentrifugation nicht zwingend nötig .. diese Karte könnte auch falsch sein

Question 14

Wovon ist der Erfolg der separation von zellbruchstücken abhängig?

Answer 14

⮚ Zusammensetzung der IB
⮚ Struktur der IB
⮚ Polypeptide der IB

Question 15

Hat die kontamination von nicht-Proteinen einen Einfluss?

Answer 15

Kein signifikanter untschied

Question 16

Hat die kontamination von plasmid DNA/ liposadcharide einen Einfluss?

Answer 16

Signifikanter Rückgang der Ausbeute an

rückgefalteten Proteine (Lysozym -10% ; β-Lactamase -20% - -40%

Question 17

Hat die kontamination von RNA einen Einfluss?

Answer 17

Kein Effekt

Question 18

Hat die kontamination von Bovine Serum Albumin (BSA) und β-Galactosidase einen Einfluss?

Answer 18

Sehr starker Rückgang
der Ausbeute (Lysozym: ca. -40%)

Question 19

Hat die kontamination von Phospholipide einen Einfluss?

Answer 19

Erhöhung der Ausbeute rückgefalteter Proteine (Lysozym

15%)

Question 20

Was sind generelle Einflüsse von kontaminanten auf den prozess von IB?

Answer 20

• Kontamination mit Fremdproteinen bewirkt immer stark
  negativen Effekt auf Rückfaltkinetik und erhöhte
  Aggregationsgefahr - Kontamination verursacht ein Faulen der
  Chromatographiesäule - Proteolyse (hemmt Kratin-Kinase Ausbeute während Lösung
  und Rückfaltung der IB) hängt von Zelltrümmern ab (je
  mehr Zelltrümmer, desto stärker die Proteolyse)

Question 21

Nachteile beim verwenden von detergenzien bei der aufreinigung?

Answer 21

• teilweise hohe Kosten
• teilweise nur schwer zu entsorgen (urea, aufgrund hohem,
  bio. O2-Gehalt)
• müssen am Ende wieder entfernt werden → zusätzliche Schritte