Kapitel 6 - Kontaminsnten und Assays Flashcards
Analyse Methoden für die Heterogenität von mAbs?
- Eine wichtige Eigenschaft von Antikörpern ist deren Heterogenität, insbesondere
Ladungsheterogenität - Analysemethoden:
o Ladung:
Nano Kapillarelektrophorese (nanoCE), Isoelektrische Kapillar Fokussierung (cIEF), Chromatofokussierung, 2dimensionale Elektrophorese, Ionenaustauschchromatographie
o Hydrophobizität:
Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC), Umkehrphasenchromatographie ( RP)
o Größe:
Size Exclusion Chromatographie (SEC), Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-Page), Natrumdodecylsulfat- Kapillarelektrophorese (SDS-CE), Massenspektrometrie
Welche Gründe gibt es um den Herstellungspreises zu verändern?
bessere Ausbeuten, besseres scale-up, neue
Technologien, zunehmende Reinheit, neue Formulierungen oder Produkt delivery Systeme →kann jedoch die Sicherheit des Systems oder Effizienz des Produkts herabsetzen
Was und warum muss ein Produkt nach einer änderung beurteilt und verglichen werden?
o Ist eine Veränderung am Produkt aufgetreten? o Falls ja, hat dies Auswirkungen auf die Sicherheit oder Effizienz?
Die meisten biologischen veränderungen am Produkt können mit Hilfe von hoch entwickelten Technologien erfasst werden. (Nach prozessänderung) Welche Fragen bleiben trotzdem?
o Wie viel Veränderung an einem Produkt ist zulässig bis die Sicherheit oder
Wirksamkeit beeinfluss wird? o Wenn eine Veränderung besteht, aber es scheint keine nachteilige Wirkung zu haben
, ab welchem Punkt handelt es sich um ein neues Produkt? o Was sind die kritischen Qualitätsattribue (CQA), die miteinander verglichen werden
müssen und sind diese wichtig für die breite Produktklasse oder wird ihre Relevanz
nur von Fall zu Fall untersucht?
Was sind qualitätsattribute (CQA)? Beispiele
o Nur noch Fragmente da →Disulfidbrücken wurden zerstört o Fehlfaltung o Variable Region verändert o Zucker verändert (Untersuchung der Glykolisierung)→keine Immunantwort wird
getriggert
Analytische methode zur Beurteilung der Heterogenität: SDS-PAGE.
Funktionsweise?
o Trennt Proteine aufgrund ihrer elektrophoretischen Mobilität (Funktion der Länge
des Polypeptids und der Ladung)
o SDS ist ein anionisches Tensid (negativ geladen), das Proteine entfaltet
Wird ein Protein auf 100°C in Anwesenheit von SDS erhitzt, umschlingt SDS das
Polypeptid Rückgrat (1,4g SDS/gPolypeptid) und überdeckt die Eigenladung
→erlaubt die Auftrennung nach der Kettenlänge, proportional zu Molekülmasse (
längere Moleküle werden im Gel stärker zurückgehalten als Kurze)
Ohne SDS würden Moleküle gleicher Größe unterschiedlich wandern, da sie
unterschiedliche Ladungen aufweisen → SDS löst dieses Problem
o Reducing SDS-PAGE: Reduktionsmittel (DTT oder 2-mercaptoethanol) werden beim
Erhitzen hinzugegeben → weitere Denaturierung durch Entfernung von
Dusilfidbrücken
Analytische methode zur Beurteilung der Heterogenität: Kapillarelektrophorese (CE)
Funktionsweise?
o Viel schneller als eine Gelelektrophorese
o Wanderung geladener Teilchen in einem (meist flüssigen) Medium unter Einfluss
eines elektrischen Feldes
o Eine Kapillare taucht mit beiden Enden in ein mit Elektrolyt befülltes Gefäß und eine
Spannung wird angelegt. Sobald die Trennung abgeschlossen ist muss der Inhalt der
Kapillare an einem Detektor vorbei geführt werden (Single point detection).
o NanoCE: ähnliche Merkmale der SDS-PAGE werden integriert: Trennung, Färbung,
Entfärbung und Detektionsschritte →Analysemethode in einem Chip
Analytische methode zur Beurteilung der Heterogenität: Isoelektrische Fokussierung (IEF)
Funktionsweise?
o Elektrophoretische Auftrennung aufgrund des relativen Gehalts an sauren und
basischen Aminosäureresten in einer Kapillare oder einem Gel → je nach pH Wert
tragen AS unterschiedliche Ladungen → am pI ist Nettoladung gleich Null → Protein
wandert nicht mehr
o Detektion mit Hilfe einer UV-Messung über die ganze Säule oder einer single point
detection
Analytische methode zur Beurteilung der Heterogenität: 2D-Dige-Gelelektrophorese Funktionsweise?
o Kombination der isoelektrischen Fokussierung (IEF) (Auftrennung aufgrund des pI)
mit einer SDS-PAGE (Auftrennung nach Massengewicht).
o Different gel electrophoresis (DIGE) ist eine Form der Gelelektrophorese, bei der drei
unterschiedliche Proben mit drei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen (z.B. Cy3,
Cy5, Cy2) markiert und aufgetrennt werden →Farbstoffe können separat detektiert
werden. Danach werden alle Proben vermischt und eine 2D-Elektrophorese
durchgeführt
o Bei 2D-DIGE-Gelelektrophorese kann man Proben aus verschiedenen
Prozessschritten direkt miteinander vergleichen und erkennt sehr schnell, ob sich
Prozesslösung verändert hat
Analytische methode zur Beurteilung der Heterogenität: High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
Funktionsweise?
o Ionenaustauschchromatographie (CEX), Analyse der Ladung von mAb o Protein A Chromatographie, In der Analytik: Quantifizierung der mAb Konzentration o Size Exclusion Chromatography (SEC), am häufigsten bei mAb: Bestimmung der Reinheit und Überwachung der Aggregation o Reversed Phase (RP) /Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)
Welche Strukturmerkmale (deren Änderung) bei mAbs können die Heterogenität erhöhen?
.antigenbinding Region .fab .hinge Carbohydryte Site .effector Funktion
Welche Formen der Heterogenität gibt es?
.disulfide shuffling .pyrpglutamate .deamidation/Oxidation .fragmentation .glycosylation .Truncation
Welchen Einfluss haben disulfidbrücken auf die Heterogenität?
Regionen, Nachweis, Auswirkung
→wichtig für den Aufbau und Zusammenhalt für die strukturelle Funktion
o Jede leichte Kette ist über eine Disulfidbrücken mit je einer schweren Kette
verbunden und jede schwere Kette ist zu der anderen schweren Kette mit zwei bis
vier Disulfidbrücken verbunden. o Jedes IgG hat 12 Domänen und jede Domäne enthält in der Kette eine Disulfidbrücke
(Intra)
Reaktion:
o Bei manchen IgG Spezien gibt es freie Sulfhydryl (-SH) Gruppen und Reaktive Cystein
Reste
(Freie Sulfhydryl aufgrund von unvollständiger Bildung einer Intra-Disulfidbrücke)
Nachweis:
o +2Da: Größenheterogenität: Massenspektrometire (Eine einzelne unvollständige
Disulfidbrücke führt zu zwei freien Sulfhydryl Gruppen und einer Erhöhung des Molekulargewichts um 2Da)
o pI: Größen-und Ladungsheterogenität: bei neutralem pH ist freies Sulfhydryl nicht
geladen, es löst aber dennoch strukturelle Veränderungen aus was die Größen- und Ladungsheterogenität beeinflusst
Auswirkung:
o Unvollständige Disulfidbrücken können „dusilfide bound scrambling“ auslösen,
besonders unter denaturierenden Bedingungen → kann zur Bildung Disulfidbrücken zwischen Fragmenten führen (sichtbar bei SDS-PAGE und SDS-CE) →v.a. bei IgG4 ein Problem, wegen der Instabilität Disulfidbrücken (zwischenkettig= inter) der Hinge-Region
Welchen Einfluss haben oligosaccharide. auf die Heterogenität?
Regionen, Nachweis, Auswirkung
o Oligosachharid Heterogenitäten treten meist während der Oligosaccharid Synthese
und der Verarbeitung auf
Reaktion:
Alle IgGs haben N-gebundedene Oligosaccharide an der Fc-Region (CH2-Domäne)
und ca 15-20% enthalten N-gebundene O. in der variablen Region.
→bei einigen mAbs ist die Überwachung der Kohlenhydrat Heterogenitäten während
des Prozesses schwierig, da „differential sialylation“, Galaktosylierung und
Fucosylierung die Funktionsfähigkeit beeinflussen können. Auftreten können:
▪ CDC: Complement-dependent cytotoxity ▪ ADCC: Antibody-dependent cellular cytotoxity ▪ Veränderung von Pharmakokinetiken ▪ Veränderung der Antigenbindungsfähigkeit
Nachweis:
o + xx Da: Größenheterogenität: Detektion mit Hilfe von Massenspektrometrie
o pI: mehr sauer
o Ladung: Oligosaccharid Heterogenität: negativer und weniger hydrophob
▪ HIC (AK mit zusätzlichen O. an der Fab Region sind weniger hydrophob und
eluieren früher) ▪ Kationentauscher (AK mit zurätzlichen O. sind negativer geladen und
eluieren früher)
Welchen Einfluss haben N-Terminal Pyroglutamat Bildung auf die Heterogenität?
Regionen, Nachweis, Auswirkung
o Der N-Terminal Rest besteht bei den schweren Ketten des humanen IgGs entweder
aus Glutamin oder aus Glutamat.
Reaktion:
o Dabei bilden die meisten Glutamine einen cyclische Struktur: Pyroglutamat Nachweis:
o -17/-18 Da: Massenspektrometrie
o pI: mehr sauer
o Ladung: negativer und mehr hydrophob (Verlust eines primären Amins am N-Ende →
mehr saure Spezies und negativere Ladung)
▪ RP/HIC (AK eluieren später)
▪ Kationentauscher (AK eluieren früher)
