Kapitel 3 DSP of mAbs: aktuelle praktiken

Question 1

Anforderungen an einen Downstreamprozess?

Answer 1

• Verbesserung der Bioviabilität
• Optimierung der Affinität
• Verbesserung der Spezifischen Bindungsfähigkeit
• Verhinderung der der Immunantwort durch Verwendung menschlicher Antikörper
• Protein engineering: Verbesserung des therapeuthischen Profils

Question 2

Was bezeichnet man als Titer?

Answer 2

Als toter bezeichnet man in der Biologie und Medizin jenes Flüssigkeitsvolumen, das aufgrund eines in ihm gelösten biologischen Stoffes (agens) gerade noch eine biologische Wirksamkeit entfaltet

Question 3

Herstellen von Hybrid-myelon-Zellen (Hybridansatz)? (Upstream)

Answer 3

o Einer Maus werden Antigen eingespritzt →Bildung von Antigen-spezifischen
Antikörpern o Die Milz der Maus wird entnommen → Eine Suspension aus den Milzzellen wird
gemacht
Die in der Suspension enthaltenen B-Zellen bilden Antigen-spezifische Antikörper o Myelomzellen: können sich schnell Vermehren, haben die Eigenschaft verloren
Antikörper zu bilden
→Versetzen der Suspension mit kultivierten Myelom Zellen (krebsartige B-Zellen)
→Teilweise hybridisieren die Antikörperbildenden Milz-Zellen mit den Myelom-Zellen
→Hybridzellen sind in der Lage ständig weiter zu wachsen während sie AK produzieren
o Das Zellgemisch wird auf ein selektives Nährmedium überführt, in dem nur
Hybridzellen wachsen können o Hybridzellen wuchern zu Klonen, die als Hybridoma Zellen bezeichnet werden
→Screening der Hybridoma Zellen (Aussuchen der Hybridomzellen, die Ak bilden) o Kultivierung der Hybridoma Zellen zur Bildung von Antigen spezifischen Antikörpern

Question 4

Wo werden Antikörper für die Therapeutik meist produziert?

Answer 4

In Säugetier zelllinien:
- NS0 Maus Myelomzellen
- PER.C6 human cells
- Chinese Hamster ovary Zellen (CHO) (am meisten verwendetet host cell: 70% alles
rekombinanten Proteine) →können sich alle drei unter serumfreien Bedingungen unbegrenzt vermehren
→Anspruch an das Expressionssystem: Hohe Produktivität und hohe Produktqualtität

Question 5

Was waren die Nachteile von Säugetierzellen in der Vergangenheit?(Plattform Prozess) und folgen von Optimierung und welche Optimierung?

Answer 5

o Niedrige Ausbeute, Mittlere Komplexität o Bedarf an Serum, Scherempfindlichkeit
.—> Optimierung durch Optimierung der medizinzusammensetzung und Bedingungen im bioreaktor.
o Eine zellspezifische Produktivität von über 20 pg/Zelle/day wird erreicht o Hohe Titer von ungefähr 10 g/L o Zelldichten von mehr als 20 Millionen Zellen pro mL (in Fed-Batch-Prozessen)

Question 6

Ablauf eines Upstream Prozesses?

Answer 6

• Inokulum
  o In Schüttelkolben oder in „Spinner Flasks“
  →Schrittweise Zunahme der Größe bzw. des Volumens o Dann in Wave-Bioreaktoren in Einwegbeuteln - Zellkultur
  o Seed-Bioreaktor: Anschließendes up-scaling in mehreren Stufen (Bioreaktoren) o Zum Schluss: Produktions-Bioreaktor: Überführung der Zellmasse in den
  Produktionsbioreaktor
  Fed-Batch Kultivierung (am häufigsten):
  o Zugabe von kleinen Volumina an Feed zur ständigen Vervollständigung der Nähstoffe
  o Kontrolle von gelöstem Sauerstoff, pH-Wert, Druck, Temperatur und Massentransfer von CO2 und Sauerstoff Perfusionszellkultur:
  o Die Zellen verbleiben im Bioreaktor und werden ständig mit Medium durchspült
  →Gleichbleibende Konzentrationsverhältnisse der Nährstoffe und Abtransport von
  Stoffwechselprodukten
  →Herausforderung: möglichst langer Erhalt der Sterilität

Question 7

Wie entwickeln sich titer? Und warum bzw. folgen?

Answer 7

Titer werden immer größer Je mehr Produkt ich bekomme (je höher der Titer), desto:

• Kostengünstiger wird der Upstream
• Teurer wird der Downstream
• Beim Upstream spielt das Fermentationsvolumen eine Rolle
• Beim Downstream die Produktmenge

Question 8

Mögliche Verunreinigungen beim Downstream Prozess?

Answer 8

• Prozessbedingte Verunreinigungen:
  o Host Cell Proteine (HCP), alles was die Zelle (außer AK) bildet o DNA o Viren (endogene und adventive) o Endotoxine o Protein A (Aus Chromatographiesäule) o Filter o Prozesspuffer o Stoffe wie Detergentien (Eingesetzt zur Reduzierung von Viren)
• Produktbedingte Verunreinigungen:
  o High molecular weight species (HMWS), Hochmolekulare Spezies o Heterogenitäten (AK mit geänderter Oberfläche durch Oxidation) o Low molecular weight species / clipped forms (LMWS), Niedermolekulare Spezies
  (AK bei dem Fragmente fehlen)

Question 9

Was haben Plattformürozesse ermöglicht? (Downstream)

Answer 9

• effiziente Prozessentwicklungen in Hinblick auf Zeit und Ressourcen zu realisieren
• eine große Anzahl an Antikörpern in klinische Studien schnell und effizient einzuführen
• durch „schablonieren“ (templating) ihrer Verfahren Vorteile in verwandten Bereichen in
  biopharmazeutischen Unternehmen zu verschaffen (z.B. in Hinblick auf die Qualität und Herstellung)

Question 10

Produzieren mit Plattformprozessen. Was ermöglicht es und was ist zu beachten, kontrollieren? (Downstream)

Answer 10

Gleicher Aufreinigungsprozess für sich sämtliche Antikörper (nur minimale Prozessveränderungen)
- AK haben alle ähnlichen Aufbau und unterscheiden sich vor allem in der variablen
RegionAusnutzen der →haben alle ähnliche physikochemische Eigenschaften sowie Ähnlichkeiten in biologischen Eigenschaften und im chromatographischen Verhalten
- Trotzdem: unterschiedliche Verhalten von mAbs in der Aufreinigung
- Große Firmen untersuchen jedes neue mAb auf die Herstellbarkeit, vor allem ob der AK mit
dem zur Verfügung stehenden Prozess und den Einstellungen produzierbar ist

Question 11

Prozessschritte eines plattformprozess im Downstream?

Answer 11

1. Zellernte, Zentrifugation/Filtration
   Entfernung von Zellen und Zellbruchstücken (vor der Chromatographie) 2. Protein A Chromatographie
   Liefert ein schon sehr gut aufgereinigtes Produkt in nur einem Schritt 3. Virusinaktivierung bei niedrigem pH
   Inaktiviert endogene und adventive Viren 4. Zusätzliche Aufreinigung: Chromatographie
   Entfernung von Produkt- und Prozessbedingten Verunreinigungen und Viren 5. Zusätzliche Aufreinigung: Chromatographie
   Entfernung von Produkt- und Prozessbedingten Verunreinigungen und Viren 6. Viren Filtration
   Entfernt endogene und adventive Viren 7. Ultrafiltration/Diafiltration
   Erhalt des endgültig formulieren Arzneistoff

Question 12

Was ist im Bezug auf Viren im Downstream Prozess zu beachten und umgesetzt?

Answer 12

→Mindestens 2 Viren-Schritte unter Verwendung von orthogonalen Prinzipien (unterschiedliche Virenabreicherungsmethoden) Niedriger pH-Wert wird nach der Protein A-Chromatographie zum Inaktivieren gehalten und am Ende Virusfiltration

Question 13

Was ist die übliche Vorgehensweise für die Zellernte (1. Prozessschritt) im Downstream Prozess?

Answer 13

→ Zentrifugation (Tellerzentrifuge) verbunden mit einer Tiefenfiltration ist üblich Ernten der Zellkultur (Säugetierzellen) und Entfernung der Zellen und Zellbruchstücke. Durch Zentrifugation, Tiefenfiltration oder Sterilfiltration wird die Zellflüssigkeit für die Chromatographie vorbereitet
. geerntete Zellkulturflüssigkeit (HCCF)

Question 14

Wichtige Merkmale für die zentrifugation bei der zellernte beim downstream Prozess?

Answer 14

o Kontinuierliche Tellerzentrifuge: Entfernung von Zellen und Zelltrümmern o →ABER: durch Scherkräfte können Zellen aufgebrochen werden (v.a. wenn
Kulturflüssigkeit nur geringe Viabilität besitzt); Teilchen von Submikrongöße können
nicht entfernt werden o Scherkräfte bei Säugetierzellen so gering wie möglich halten (s.O.)

Question 15

Wichtige Merkmale für die tiefenfiltration bei der zellernte beim downstream Prozess?

Answer 15

.positiv geladen: Dicke 2-4mm
o HCCF Strom fließt senkrecht zum Filter (besteht aus Cellulose, Diatomerde und
einem ionisch geladenen Harz als Bindemitter) o Trennprinzip beruht auf Größe (physikalisch) und Ladung (elektrokinetische
Eigenschaften) o DNA bei pH 7 (Fermentations pH) negativ geladen o Wird meist Membranfiltern, Chromatographiesäulen und Virenfiltern vorgeschaltet,
um deren Kapazität zu erhalten

Question 16

Wichtige Merkmale für die querstrommikrofiktration bei der zellernte beim downstream Prozess?

Answer 16

o Porengröße 0,22µm, Feststoffanteil der Kulturflüssigkeit <
3%
o HCCF Strom fließt quer zur mikroporösen Membran o Gute Ausbeuten werden mit Ultrafiltrations- (Aufkonzentration durch
Volumenreduktion) und Diafiltrationsschritten (Waschen und Pufferwechsel) o Fouling stellt Problem dar → Vergrößerung der Poren → Notwendigkeit eines zweiten
Aufreinigungsschrittes (Tiefenfiltrationsschritt)

Question 17

Was passiert beim downstreamprozess beim capture (2. prozessschrit)

Answer 17

Affinitätschromatographie
•Erster Schritt im Prozess, bei dem man aus Zellbrühe das Produkt extrahieren möchte Protein A Chromatographie: erreicht in einem Schritt hohen Reinheitsgrad (<98%) und hohe Recovery-Werte
- Host Cell Proteine, DNA, Komponenten des Zellkulturmediums, Viren und andere
Verunreinigungen werden durch die Säule durchgespült - Antikörper bindet an Protein A (stationäre Phase) - „Rucksackproteine“ binden an AK und verunreinigen Eluat (darum nur 98% Reinheit) - Laufpuffer: pH 6-7
Waschschritt um nicht spezifisch gebundene Verunreinigungen zu entfernen
Elutionspuffer: pH 2,5-4
→Nachteil des niedrigen pH-Wertes: eventuell Aggregation der AK und Host Cell Proteine, die
an die Säule gebunden wurden, können ausfallen. → Fouling der Chromatographiesäule oder
Verstopfung des Tiefenfilters

Question 18

Was passiert bei der virenentfernung beim downstreamprozess? (3. prozessschritt)

Answer 18

Inaktivierung der Viren durch niedrigen pH-Wert

Question 19

Was passiert beim polishing beim Downstream Prozess? (4. prozessschitt)

Answer 19

Chromatographie: pH7 •Eine oder zwei Chromatographieschritte Diese Schritte sorgen zusätzlich für die Entfernung von:
▪ Viren ▪ Host Cell Proteinen ▪ DNA ▪ Aggregate ▪ Unerwünschte Produktvarianten ▪ Kleine Verunreinigungen
- Kationen oder Anionentauscher → stets zu Beginn da höchste Kapazität
AK pI: 8-9 (zu 90% basisch)

Question 20

Wie funktioniert ein kationentauscher? Wie wird Elution durchgeführt, was bindet?

Answer 20

Elution mit Salzgradient (Ionenstärke ändern)
▪ Mode: Bind and elute (AK mit pI im neutralen bis basischen) →AK binden,
Verunreinigungen laufen durch (pH 7: AK positiv, Kontaminanten Negativ)

Question 21

Wie funktioniert ein Anionentauscher? Wie wird Elution durchgeführt, was bindet?

Answer 21

Elution mit Änderung des pH Werts
▪ Mode: flow through (AK mit pI im basischen Bereich) →AK geht durch,
Kontaminanten binden
→man braucht sehr große Säule (mit hoher Kapazität um alle=genau 2%
Kontaminanten zu erwischen) ABER es findet eine Aufkonzentrierung der AK
durch eine Elution mit weniger Puffer statt ▪ Mode: elute and bind (AK mit pI im sauren bis neutralen Bereich) → ?
Zur Entfernung von Prozess- und Produktbedingten Verunreinigungen

Question 22

Wie funktioniert die hydrophobe interaktionschromotographie (HIC)? Wie wird Elution durchgeführt, was bindet?

Answer 22

→meist nach Protein A-Affinitätschromatographie oder als Polishing step nach
Ionentauscherchromatographie
Aggregate sind hydrophober als AK
▪ Mode: flow through (AK eluieren zuerst, Aggregate sind hydrophober und
eluieren als letztes) ▪ Mode: bind and elute; Elution mit einem Gradient (Salzkonzentration)
können HCP, DNA und Aggregate entfernt werden

Question 23

Wie funktioniert die Hydophibic charge induction chrimatographie? (Multi Modal)

Answer 23

Methode basiert auf der pH Abhängigkeit der Liganden, die bei niedrigem pH
ionisieren.
Ak binden Salzunabhängig an die Säule; Elution mit einem höheren pH-Bereich wie
bei Protein A möglich
→gute Alternative zu Protein A-Chromatographie, weil das Harz günstiger ist
→ABER: mehr nicht spezifische Bindungen kommen zustande; weniger effizient

Question 24

Wie funktioniert die mixed Mode chromatographie? (Multi Modal)

Answer 24

Harze mit mehreren Liganden (z.B. Capto MMC und Capto Adhere)
→Kombination von verschiedenen Arten von Wechselwirkungen (Ionische Interaktion
, Wasserstoffbindungen, hydrophobe Interaktionen)
→Capto Adhere wird meist als zweiter Schritt nach der Protein A-Chromatographie
angewendet zur Entfernung von Aggregaten, HCP und ausgewaschenem Protein A.

Question 25

Wie funktioniert die hydroxylapatit chromatographie? (Multi Modal)

Answer 25

Ceramic hydroxyapatit ist eine Art Calcium Phosphat

Question 26

Warum werden Membrane und filtration beim downstreamprozess eingesetzt (6.-7. prozessschritt)?

Answer 26

Wird von ab der ersten Klärung der Zellkulturbrühe bis zur letztes Sterilfiltration der gereinigten Brühe verwendet.
- Tiefenfiltration
- Membranchromatographie
Funktion ist ähnlich wie eine gepackte Säule bei einer Chromatographie, aber es hat die Form eines herkömmlichen Filtrationsmodules. Verwendung von mikroporösen Membranen, die innen an den Porenoberflächen Liganden tragen können. Vorteil gegenüber herkömml. Chromatographie: Beseitigung der diffusiven Poren → Der Massentransfer von Molekülen hängt von Konvektion ab und nicht von Duffision. Die Bindekapazität der Membran ist weitgehend unabhängig von der Durchflussrate
- Virus Filtration
Säugetierzellen können während dem Prozess endogene Retroviren produzieren oder sich mit adventiven Viren infizieren. Geforderte Reinheit: endogene Retroviren 12-18 log10; adventive Viren 6 log10
Am Ende muss das Produkt noch mal gereinigt und konzentriert werden, sowie in den final formulation buffer diafiltriert werden:
- Ultrafiltration
Es handelt sich um ein druckbetriebenes Membranverfahren. →Aufkonzentrierung des AK und Pufferwechsel
- Querstromfiltration
Zukunftstechnik: high performance tangential flow filtration (HPTFF) Zweidimensionale unit operation, bei der sowohl Größe und Ladungsunterschiede zur Auftrennung genutzt gleichzeitig wird Produkt aufkonzentriert und Puffer gewechselt