Fundamentos de PCR Cuantitativa en Tiempo Real

Question 1

PCR ¿cuando?

Answer 1

Kary Mullis 1983

Question 2

¿Qué es PCR?

Answer 2

Técnica de replicación in vitro de una mol de DNA genómico

Question 3

¿Que delimita longitud del fragmento que se quiere replicar en PCR?

Answer 3

Primers / cebadores / oligonucleótidos

Question 4

Tipos de PCR

Answer 4

Convencional / punto final
Cualitativo
Semi cuantitativo
Cuantitativo
Múltiple

Question 5

PCR convencional

Answer 5

Amplificación de región específica
Se evalua en gel de agarosa o acrilamida

Question 6

PCR cualitativo

Answer 6

Identificar presencia o ausencia de un frag específico
Dx de enf infecciosas

Question 7

PCR semicuantitativo

Answer 7

Conocer niveles de expresión de un gen (RNAm)
(Biopsias)

Question 8

PCR cuantitativo

Answer 8

Medir # de microorganismos o RNAm de un gen

Referencia: curva de concentraciónes conocidas de DNA

Question 9

Amplificación

Answer 9

Complementaridad
Dirección 5’-3’ con 3’ libre
3 etapas
- Desnaturalización
- Replicación
- Elongación

Question 10

PCR múltiple

Answer 10

Amplificación de varias regiones en una misma reacción
Cada región con su pares de oligos

Question 11

Componentes de amplificación

Answer 11

DNA
Primers
DNA pol
dNTPs (desoxinucleótidos)
Magnesio (cofactor)

Question 12

Los dNTPs estan…

Answer 12

Trifosfatados (estabilidad)

Question 13

Concentración dNTPs

Answer 13

50-200 microMol para sintetizar 6.5-25 mg DNA

Question 14

Ciclos de amplificación (se repiten de 30-35 veces)

Answer 14

Desnatur 95º / 30seg
Alineamiento 50-60ª / 30-40seg
Extensión 72º / 30seg

Question 15

Pasos de amplificación en PCR

Answer 15

1 Desnaturalización 95º / 5min
2 Ciclos de amplificación (se repiten de 30-35 veces)
3 Amplificación final 72º / 2-3min
4 Almacenamiento temporal 4º

Question 16

Amplificación IMAGEN

Answer 16

Question 17

PCR en tiempo real ¿cuando?

Answer 17

Higuchi et al 1992

Question 18

PCR tiempo real

Answer 18

Análisis simultaneo de distintas secuancias en tiempo real

Question 19

Pasos PCR tiempo real

Answer 19

Amplificación
- Desnaturalización
- Alineamiento
- Extensión
Detección mediante fluorecencia
- SYBER green
- TaqMan

Question 20

SYBER green & TaqMan IMAGEN

Answer 20

Question 21

SYBER green

Answer 21

Fluoroforo se va metiendo entre hebras a medida que se va sintetizando y brilla con laser verde

Para estudios de expresión porque es inespecífico

Question 22

TaqMan

Answer 22

Detecta región específica / la sonda es específica
En 1 sola hebra
Se utiliza para estudiar SNPs

Question 23

¿Qué es la sonda de TaqMan?

Answer 23

Pedazo de DNA complementario específico de región y cuentan con primer

Question 24

¿Como funciona TaqMan?

Answer 24

La sonda se une a 1 hebra y cuando la polimerasa hace la complementaria rompe la sonda y brilla

Question 25

Ventajas de PCR tiempo real

Answer 25

Calcula eficiencia de la reacción
No utiliza gel
Rapidez

Question 26

Aplicaciones PCR tiempo real

Answer 26

Análisis de expresión
- Cancer
Investigación
- Detección de polimorf aso a enf
- Estudios de aso caso-control
Diagnóstico
- SARS-COV2