Fundamentos de PCR Cuantitativa en Tiempo Real Flashcards
PCR ¿cuando?
Kary Mullis 1983
¿Qué es PCR?
Técnica de replicación in vitro de una mol de DNA genómico
¿Que delimita longitud del fragmento que se quiere replicar en PCR?
Primers / cebadores / oligonucleótidos
Tipos de PCR
Convencional / punto final
Cualitativo
Semi cuantitativo
Cuantitativo
Múltiple
PCR convencional
Amplificación de región específica
Se evalua en gel de agarosa o acrilamida
PCR cualitativo
Identificar presencia o ausencia de un frag específico
Dx de enf infecciosas
PCR semicuantitativo
Conocer niveles de expresión de un gen (RNAm)
(Biopsias)
PCR cuantitativo
Medir # de microorganismos o RNAm de un gen
Referencia: curva de concentraciónes conocidas de DNA
Amplificación
Complementaridad
Dirección 5’-3’ con 3’ libre
3 etapas
- Desnaturalización
- Replicación
- Elongación
PCR múltiple
Amplificación de varias regiones en una misma reacción
Cada región con su pares de oligos
Componentes de amplificación
DNA
Primers
DNA pol
dNTPs (desoxinucleótidos)
Magnesio (cofactor)
Los dNTPs estan…
Trifosfatados (estabilidad)
Concentración dNTPs
50-200 microMol para sintetizar 6.5-25 mg DNA
Ciclos de amplificación (se repiten de 30-35 veces)
Desnatur 95º / 30seg
Alineamiento 50-60ª / 30-40seg
Extensión 72º / 30seg
Pasos de amplificación en PCR
1 Desnaturalización 95º / 5min
2 Ciclos de amplificación (se repiten de 30-35 veces)
3 Amplificación final 72º / 2-3min
4 Almacenamiento temporal 4º
Amplificación IMAGEN
PCR en tiempo real ¿cuando?
Higuchi et al 1992
PCR tiempo real
Análisis simultaneo de distintas secuancias en tiempo real
Pasos PCR tiempo real
Amplificación
- Desnaturalización
- Alineamiento
- Extensión
Detección mediante fluorecencia
- SYBER green
- TaqMan
SYBER green & TaqMan IMAGEN
SYBER green
Fluoroforo se va metiendo entre hebras a medida que se va sintetizando y brilla con laser verde
Para estudios de expresión porque es inespecífico
TaqMan
Detecta región específica / la sonda es específica
En 1 sola hebra
Se utiliza para estudiar SNPs
¿Qué es la sonda de TaqMan?
Pedazo de DNA complementario específico de región y cuentan con primer
¿Como funciona TaqMan?
La sonda se une a 1 hebra y cuando la polimerasa hace la complementaria rompe la sonda y brilla
Ventajas de PCR tiempo real
Calcula eficiencia de la reacción
No utiliza gel
Rapidez
Aplicaciones PCR tiempo real
Análisis de expresión
- Cancer
Investigación
- Detección de polimorf aso a enf
- Estudios de aso caso-control
Diagnóstico
- SARS-COV2
