5.5 Fundamentos de PCR cuantitativa en tiempo real

Question 1

Facts de amplificación

Answer 1

• PCR (reacción en cadena de polimerasa)
• Kary Mullis (1983)
• Técnica de replicaciín in vitro de una molécula de ADNg
• Longitud del fragmento que se quiere replicar estará delimitado por los primers o cebadores u oligonucléotidos

Question 2

PCR convencional

Answer 2

• Amplifica una región genética específica
• Se evalúa por medio de gel de agarosa o acrilamida

Question 3

PCR cualitativo

Answer 3

• Permite id presencia o ausensia de un fragmento específico
• Dx de enfermedades infecciosas

Question 4

PCR semicuantitativo

Answer 4

• Permite conocer los niveles de expresión de gen (ARNm) (Biopsias)

Question 5

PCR cuantitativo

Answer 5

• Permite medir la cantidad de microorganismos o en ARNm de un gen en particular
• Como referencia una curva con muestras con concentraciones conocidas

Question 6

PCR múltiple

Answer 6

• Amplificación de varias regiones génicas en una misma reacción de PCR
• Cada región cuenta con su pares de oligos

Question 7

Amplificación

Answer 7

Por PCR, principios básicos:
- complementariedad
- Dirección 5’-3’ (requiere 3’ libre)

Etapas: 1) desnaturalización, 2) replicación, 3) elongación

Question 8

Amplificación: componentes

Answer 8

• ADN
• Primers
• ADN polimerasa
• dNTPs (desoxinucleótidos)
• Magnesio (cofactor)

Question 9

Facts de dNTPs

Complementos de amplificación

Answer 9

• Desoxinucleótidos libres en forma trifosfatada (estabilidad), estos fosfatos ayudarán a formar el enlace fosfodiester (nt-nt)
• Concentración: 50-200mM -> para sintetizar 6.5-25 mg de ADN

Question 10

Proceso de amplificación

PCR en tiempo final

Answer 10

1. Inicio de desnaturalización (95°C; 5 min)
2. Ciclos de amplificación (30-35): temp de desnaturalización (95°C; 30s), temp de alineamitneo (50-60°C; 30-40s), temp de extensión (72°C, pol)
3. Amplificación final (72°C, pol 3 min)
4. Almacenamiento temporal (4°C)

Question 11

Facts de PCR en tiempo real

Answer 11

• Higuchi et al (1992); describieron una modificación de la técnica de PCR en tiempo real
• Adaptando la técnica a un análisis simultáneo de varias secuencias -> PCR en tiempo real o cuantitativa
• En tiempo real se va observando el crecimiento de la curva de amplificación

Question 12

Proceso de PCR en tiempo real

Answer 12

1. Amplificación
   - Desnaturalización
   - Alineamiento
   - Extensión
2. Detección (x fluorescencia)
   - SYBER green
   - TaqMan

Question 13

Facts de SYBER green

Answer 13

• Intercalante de ADN (+conocido: bromuro de etidio)
• Se inserta en medio de cadena mientras se va haciendo
• No es especifico (se mete a cualquier ARN)
• Cuando se detecta va a fluorescer y se ve con láser
• Curva: + ciclos, + SYBER green
• Usada para análisis de expresión

Question 14

Facts de TaqMan

Answer 14

• Estudia SNPs
• Probe (sonda) + floroforo + quater (apagador)
• Probe será complementario a hebra líder, polimerasa irá agg nt y rompe probe -> suelta foroforo y brilla pq apagador queda lejos
• Permite genotificar

Question 15

¿Qué permite el análiis de PCR en tiempo real?

Answer 15

Id fluorescencia conforma avanza la reacción

Question 16

Pros de PCR en tiempo real

Answer 16

• Posible calcular eficencia de reacción
• No necessario hacer geles para comprobar resultado
• Mayor rapidez y eficiencia en este tipo de PCR en comparación con la de punto final

Question 17

Aplicaciones de PCR de tiempo real

Answer 17

• Análisis de expresión: cáncer
• Investigación: etecta polimorfismos asociados a enfermedades (estudios de asociación caso-control)
• Dx de enfermedades: COVID (SARS-COV2)