1.1 Secuenciación masiva de genomas Flashcards
Método de secuenciación en 1977
- Por Sanger
- Basado en agg ddNTPs
Diferencia entre ddNTPs y nucleótidos
ddNTPs= terminadores; no tienen OH en C3´ por lo que no se pueden unir
Fundamento de la secuenciación de Sanger
- Replicación con ADN polimerasa
- Crea cadenas de ADN de varias longitudes que serán separadas por tamaño por electroforesis
Metodología de secuenciación de Sanger
- ADN polimerasa amplificará cadena sencilla
- Lectura fragmentos de 50-300 nucleótidos
- Separación de cadenas por diferentes ddNTPs
Diferencia entre si se une un nucleótido normal y un ddNTPs
- Nucleótido: la cadena seguiría de forma normal, cadenas completas
- ddNTPs: la cadena se cortará, es aleatorio y crea fragmentos de diferentes longitudes de la cadena
¿Qué lado de la cadena tendrán todos en común?
El extremo 5´, porque los extremos 3´variarán dependiendo del ddNTP que se le una
Next generation secquencing: tipos de ténicas nuevas
- Por hibridación: 454 pirosecuenciación SOLID (rocher) y solexa (illumina)
- Por secuencia de una sola molécula en tiempo real: SMRT
Facts de secuenciación automatizada por fluorescencia
- 1990
- Uso de 4 colorantes (dif longitudes de ondas) en cuatro reacciones específicas de base
- Un solo pocillo
- Detección de onda por medio de laser y envian info a compu
Facts de pirosecuenciación
- Lee las secuencias a la misma vez que se van creando
- No usa gel
- 200-400 pb
- Nucleótido correcto unido = luz
- dNTPs no unidos serán degradados por apirasa
- Más rápida
- Más precisa
Proceso de la pirosecuenciación masiva
- ADN se corta en fragmentos cortos y preparan plantillas de ADN de cadena sencilla
- Se añaden adaptadores a los extremos del ADN
- Fragmenos se unen a esféras (aprovechando la unión biotina-estreptavidina)
- en gotas de emulsión = fragmentos (amplificandose) + esfera
- Después de amplificación, se rompen las gotas y colocamos esferas en pocillos
- Lava secuencia fija de nucleotidos sobre esfera y detecta luz producida a la unión de nucleótidos
Proceso de como se hace la luz en pirosecuenciación
- ADN pol añade nucleótido, si es el correcto, se libera pirofosfato (PPi)
- PPi → ATp (por ATP sulfuroilasa)
- ATP + enzima luciferasa → genera luz
- Cantidad de luz indica cantidad de ATP = nucleótido que se incorporó
Facts de PCR en embulsión Ion Torrent
- Adaptadores están ligados a extremos de fragmentos de ADN de biblioteca (adaptadores permiten que fragmentos se unan a perlas de embulsión)
- En un único tubo, mezcla oleosa + frag ADN + perlas + PCR (perlas = macrorreceptores para PCR)
- PCR conduce a amplificar cada gota
En la PCR en embulsión Ion Torrent se liberará esto cada que se una un aa
Pt-
Facts de solexa
- Por Illumina
- Amplificación en puente o cluster PCR
- Se encuentra con fragmentos de ADN adheridos a una cél de flujo
Dos conceptos claves para entender la tecnología del next generation secuencing
- Cobertura: promedio de número de lecturas que se alinean a una seucuencia de referencia (horizontal)
- Profundidad: número de veces que ha sido secuenciado una base en genoma (vertical)
