Vf Flashcards
Conjugación
proceso de transferencia horizontal de material genético entre una célula bacteriana donadora y una receptora por CONTACTO DIRECTO
Transducción
el DNA es transferido de una bacteria a otra mediante un BACTERIÓFAGO
transducción generalizada
transferencia de cualquier región del genoma bacteriano
transducción especializada
transferencia de loci adyacente al sitio de integración del profago
DNA exógeno es introducido en una célula mediante un vector viral
transducción
En la transducción, cómo puede integrarse el DNA al genoma de la bacteria
por recombinación sitio específica (homología de secuencia)
Transformación
variación hereditaria de una célula bacteriana susceptible, originada por la captación de ADN desnudo libre en el medio
Transformante
célula que ha sido transformada
Principio de transformación de Griffith
una bacteria mueta se degrada y libera fragmentos de ADN al entorno
Competencia
estado fisiológico característico limitado en el tiempo que permite captar ADN del medio externo
factores ambientales de la competencia
densidad celular del cultivo
temperatura
ph
nutrientes
Formas de codificar la competencia
en el genoma
de forma artificial
Transformación natural
codificada en los genes celulares
Transformación artificial
no está codificada en los genes celulares
es inducida por procedimientos en donde las células son convertidas en permeables
Estas técnicas se basan en tratamientos químicos o físicos que producen microporos en la célula
transformación artificial
Química
las células e incuban en hielo con el DNA exógeno en presencia de cationes divalente como Ca (CaCl2)
Qué es lo que causa que entre el DNA a la célula en la química
shock térmico
Microinyección
bajo el microscopio empleando microagujas y micromanipuladores
Lipofección
el DNA se encapsula en lipomas las cuales se fusionan enseguida con la membrana celular
Electroporación
aumento de permeabilidad en la membrana celular mediante aplicación de un campo eléctrico (10-20 kV/cm)
Se forman poros a través de los cuales puede entrar el DNA exógeno
electroporación
Puede causar la muerte celular en la electroporación
exposición excesiva a campos eléctricos
Vectores virales
se aprovecha la capacidad natural que tienen los virus de ingresar su información genética a la célula blanco
Biobalística
pequeñas partículas de oro o tungsteno cubiertas de ADN se disparan a las células
Eficiencia de transformación en biobalística
baja
Clonación
variedad de procesos que pueden usarse para producir copias genéticamente idénticas de un ente biológico
Clonación DNA in vivo (celular)
amplificación de moléculas de ácido nucleico mediante su introducción, asistida por vectores, en células en cultivo
Clonación proteína in vivo (celular)
producción de proteínas mediante la introducción asistida por vectores, en células en cultivo, de la información genética requerida para la síntesis de dicha proteína
En la clonacion celular se requiere de
vectores
El vector es…
un portador
Molécula de DNA cuya misión es unirse con el fragmento de DNA llamado inserto
vector
con quien se une el vector
con el inserto
Son elementos genéticos con capacidad autoreplicable
vectores
el inserto puede ser…
ADN genómico
cADN
producto de la retrotranscripción del ARN
producto de PCR
aspectos para seleccionar un vector
- tamaño máximo del inserto que admiten
- tipo de célula anfitriona
- plásmidos
Clasificación de vectores
de clonación
de expresión
Finalidad del vector de clonación
almacenar secuencias y permitir la obtención de grandes cantidades del inserto
Capacidad de expresar el DNA recombinante
vector de expresión
Objetivo del vector de expresión
producir un transcrito (RNA) o la proteína producto de ese transcrito
Qué posee el vector de clonación
secuencias que le permiten mantener su replicación y la del DNA que transportan, independientemente del DNA genómico
secuencias codificadas para un gen de elección. El producto del gen no debe de estar presente en el tejido u organismo
sitios múltiples de clonación
Sitios múltiples de clonación
PERMITE LA SELECCIÓN DE SITIOS DE RESTRICCIÓN PARA LA CLONACIÓN
genes de resistencia
ampicilina
genes reporteros
Lac Z (b-galactosidasa)
GFP (proteína verde fluorescente)
luciferasa
genes que complementan defectos nutricionales en cepas mutantes
E. coli TRP1
Características del vector de expresión
secuencias reguladoras
promotor
operador
sitio de unión a ribosa (SUR)
secuencia de término de la transcripción (TT)
secuencia de poliadenilación (eucariota)
codon de inicio y paro de la traducción
SUR
shine-dalgarno (procariotas)
kozak (eucariotas)
Vector pCMVTNT
región potenciadora o promotora de CMV que permite una fuerte expresión constitutiva en muchos tipos de células
Procedimiento general
1 preparación de inserto
2 preparación del vector
3 preparación de la construcción final
4 transformación
5 selección de transformantes
6 propagación de transformantes
7 purificación de vectores o proteínas recombinantes
1 preparación de inserto
el DNA se corta con la o las enzimas de restricción adecuadas
2 preparación del vector
el policonector o sitio múltiple de clonación (MCS) permite emplear cualquier combinación de enzimas de restricción
3 preparación de la construcción final
unión covalente in vitro de un inserto de DNA cortado, empleando una ligasa
5 selección de transformantes
cuando la célula ya fue transformada crece en medios de cultivo selectivos solidos
métodos genéticos o de selección fenotípica
levantamientos de colonias o placas
6 propagación de transformantes
se seleccionan las colonias de interés y se crecen en medios líquidos
Cuando se lleva a cabo la clonación
división celular junto con la del genoma, formación de copias de rDNA incorporadas
Posee un gen de resistencia a ampicilina y el gen Lac Z
vector plasmídico pUC18/19
interrumpe el gen LacZ
MCS (sitio múltiple de clonación)
X-gal
SUSTRATO de la B-galactosidasa-LacZ
Es X-gal es hidrolizado a…
galactosa y 5-dibromo-4,4-dicloro-índigo
Confirma la actividad de la B-galactosidasa
el color azul
IPTG
INDUCTOR de la B-galactosidasa
Análogo no-hidrolizable de la alolactosa que es un metabolito isómero de la lactosa, dispara la transcripción del operón Lac
IPTG
Ampicilina
NO permite el crecimiento de las colonias bacterianas que no portan el gen de resistencia que posee el vector pUC18
disueltos en el medio de agar de una placa de cultivo
ampicilina
IPTG
X-gal
LacZ
codifica para la B-galactosidasa que hidroliza a X-gal y genera colonias color azul
genera color azul
hidrolización de X-gal por la B-galactosidasa
Si se inserta un fragmento de ADN en el MCS…
se inactiva este gen y se vuelve incapaz de sintetizar B-galactosidasa funcional, y da color blanco
características de colonias color azul
crecimiento indica que fueron transformadas con el pUC18 y poseen el gen de resistencia a la ampicilina, Lac Z inactivo porque el vector está vacío
