IVb. Extracción y cuantificación de proteínas Flashcards
Secuenciación
identificar el gen que la codifica y poder clonarla
Para qué nos sirve extraer proteínas
secuenciación
expresar una proteína recombinante silvestre
producción de anticuerpos
análisis estructurales
estudiar función, regulación, interacciones con otras moléculas
Disrupción mecánica
de tejidos principalmente, no necesaria si la muestra proviene de cultivo celular
Licuadora
la muestra se tritura mediante cuchillas rotatorias
Tipo de muestra de licuadora
gran cantidad de tejido
Homogenizador Dounce
tubo de vidrio con pistón ajustado moja las células por acción de corte
Tipo de muestra de Homogenizador Dounce
células tisulares
Homogenizador de ultrasonidos
ondas de sonido emitidas por una sonda para romper las membranas celulares
Tipo de muestra de Homogenizador de ultrasonidos
células, tejidos, bacterias
Pulverización en nitrógeno líquido
la muestra se pulveriza utilizando un mortero y una almirez refrigerados
Tipo de muestra de Pulverización en nitrógeno líquido
tejido animal o vegetal
Perlas de vidrio
la ruptura celular se produce por agitación de las perlas de vidrio
Tipo de muestra de perlas de vidrio
levaduras
Buffer de lisis con:
- inhibidor de proteasas
- detergente
- estabilizadores
Inhibidor de proteasas
EDTA
Nucleasas
degradación de ácidos nucleicos, reduce viscosidad de solución simple
Cocktel de diferentes inhibidores cada uno con especificidad para diferentes proteasas en particular, evitando…
degradación global de las proteínas en el extracto
Inhibidor proteasas: aprotinina
enzima diana: proteasas de serina
Inhibidor proteasas: EDTA
enzima diana: Mg/ Mn
metaloproteasas
Inhibidor proteasas: EGTA
enzima diana: Ca
metaloproteasas
Inhibidor proteasas: leupeptin
enzima diana: proteasas de serinas
cisteínas
Inhibidor proteasas: pepstatina A
enzima diana: proteasas de aspartico
Inhibidor proteasas: PMSF
enzima diana: proteasas de serina
Al centrifugar…
en el sobrenadante se encuentran todas las proteínas solubles de la célula y en el pellet las membranas y proteínas hidrofóbicas de membrana
Precipitar las proteínas solubles del sobrenadante
sulfato de amonio. no desnaturalizante
etanol y acetona
Ensayo de Bradford
cuantificación de proteínas
Ensayo más ampliamente utilizado
ensayo de Bradford
En qué se basa el ensayo de Bradford
en el colorante azul de Coomassie G-250 en una solución ácida
Se realiza el ensayo de Bradfrod
una curva con concentraciones conocidas
