IVd. Secueciación de proteínas y cristalografía Flashcards
Aportación de Frederick Sanger
determinar la secuencia de AA de las cadenas polipeptídicas de la hormona insulina
Si una proteína se aisla…
puede analizarse para encontrar la secuencia de AA que la conforman
Flujo de trabajo
- extracción de proteínas
- separación de las proteínas
- procesamiento para secuenciación
- extracción de proteínas
cuantificacióon
- separación de las proteínas
SDS PAGE
2D-criterio de pureza- cromatografía de exclusión molecular, de afinidad, de intercambio iónico
Procesamiento para secuenciación
- agentes reductores
-alquilación de cisteínas
-hidrólisis
-digestiones
aliminan los puentes disulfuro
agentes reductores
evitar puentes disulfuro
alquilación
Qué permite la hidrólisis completa
determinar cuales AA están presentes y en qué proporción
Digestiones ondividuales con dos diferentes agentes para obtener…
péptidos menos 3KDa
purificación de los fragmentos y secuenciación
determinación de la secuencia global por traslape de los fragmentos individuales
En la especificidad de algunos métodos para la fagmentación de cadenas polipeptídicas, todos son protesas excepto…
el bromuro de cianógeno
Dónde puede ocurrir la ruptura
en el extremo carboxilo C o en el amino N del aa indicado
Secuenciación de proteínas
reacciones para identificar el aminoácido N-t
espectrofotometría de masas
reacciones para identificar el aminoácido N-t
sanger
edman
Espectrofotometría de masas
MALDI
ESI
MS/MS
Secuenciación de Sanger
reactivo 2,4-dinitro-fluoro-fenilo
Degradación de Edman
reactivo de Edman: fenilisotiocianato
De dónde se obtiene la feniltiohidantoína
del aa N-terminal y queda el resto del péptido intacto
Dónde se empleó la degradación de Edman
en secuenciadores automáticos
Los secuenciadores automáticos solo pueden secuenciar…
los primeros 40 aa del extremo N-t
Por qué solo se pueden secuenciar 40aa
porque el rendimiento de la reacción no es del 100% y se pierde péptido poco a poco, al final no queda nada
En la degradación de Edman, se puuede hidrolizar la proteína original y…
realizar la secuenciación de cada fragmento por separado
En el perfil de alución de los PTH-aa
entre + pico, hay + aa
Se origina cuando la secuencia de la proteína es cortada
un péptido específico
Los valores exactos del conjunto de las masas moleculares de los péptidos es…
la representación única de la estructura primaria de una determinada proteína
Espectro de masas
información BIDIMENSIONAL que representa la abundancia de los diferentes tipos de iones en función de la relación masa/carga
Qué evidencia el espectro de masas
la relación masa/carga de los péptidos analizamos y se convierte en una huella digital de la proteína analizada
Si la muestra inicial analizada no esta constituida únicamente de una sola proteína sino de una mezcla…
permite identificar cuales serían esas proteínas que conforman la mezcla
Espectrofotometría de masas
ionización de los componentes de la muestra en fase gaseosa
Separación de las especies iónicas resultantes de acuerdo a su…
relación masa/xarga eléctrica utilizando campos electromagnéticos en el vacío
La espectrofotometría de masas permite…
deducir la masa de la molécula con mucha precisión
m/z no se podía aplicar para…
macromoléculas ya que el calentamiento para transitar a fase gaseosa las descomponía
Componentes básicos de la espectrofotometría de masas
sistema de ionización
analizador de masas
detector de iones
Sistema de ionización
vaporización e ionización a partir de moléculas NEUTRAS
Analizador de masas
separación de los iones en función de su relación masa/carga
Deterctor de iones
detección de los iones formados y registro adecuado de la información
MALDI
muestras ne fase sólida
MALDI fases
1.irradiación
2.disrupción
3.ionización y desolvación
ESI
muestras en fase líquida
Analizadores de masas
TOF
TOF-TOF
Trampa de iones tridimensional
Q
TOF
La muestra de iones se acelera antes de entrar al tubo de tiempos de vuelo
en TOF, para una energía determinada, los iones pesados…
se deslizan lento, el tiempo que tardan en atravesar el tubo nos dice su masa
TOF-TOF
se puede abrir y cerrar rápidamente la compuesta de paso entre el primer tubo y el TOF tube
En el TOF-TOF, el aislamiento …
no funciona cuando es espectro demasiado congestionado
Trampa de iones
iones atrapados aplicando una radiofrecuencia en la dirección radial y un potencial continuo repulsivo en lente de salida
Cómo salen los iones de la trampa
por un voltaje auxiliar
Quadrupolo
cuatro barras matálicas de sección circular o hiperbólica, rectas y paralelas
En Quadrupolo, por pares alternos…
se aplica un potencial constante V que origina un movimiento lateral iscilante de los iones
Funciona como un verdadero filtro de masas
Qudrupolo
Arreglos MALDI
TOF
Arreglos ESI
Q
trampa de iones
MS/MS
dos espectrómetros en tandem
Detección de iones e interpretación
se detecta el flujo iónico, se amplifica y se transmite a la computadora
En el eje abscisas (X)
la masa de los iones
En el eje de las ordenadas (Y)
la intensidad (abundancia)
El espectro de masas evidencia…
el número de componentes en la muestra y el peso molecular de cada componente
Cristalografía de rayos X
para determinar la estructura TRIDIMENSIONAL de una macromolécula mediante análisis del patrón de difracción de los rayos X por un compuesto cristalino
La cristalografía de rayos X determina…
la separación de los átomos de una red cristalina midiendo ubicaciones de manchas producidad en una película fotográfica
Resolución de forma general
distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar dos puntos como entidades separadas
De qué depende la resolución
de la longitus de onda de la luz
A menor longitud de onda de la luz…
mayor resolución
Un haz de luz de una longitud de onda determinada no puede utilizarse para…
examinar detalles estructurales más pequeños que su propia longitud de onda
El espectro electromagnético lo podemos ver entre
400 - 750 nm
Los rayos X tienen longitudes de onda comparables a las…
distancias atómico-moleculares a 10 picómetros
Se producen al someter una carga eléctrica a una aceleración
rayos X
Cómo es la emisión de los e de la macromolécula
en todas direcciones
Interferencia constructiva
en la pantalla aparece una mancha
Interferencia destructiva
en la pantalla NO hay señal
La amplitus de onda aumenta cuando…
se encuentran en fase
Regiones brillantes
interferencias constructivas
Regiones oscuras
interferencias destructivas
Las distancias de las manchas son…
inversamente proporcional a las distancias en la red real
