IVe. Inmunotécnicas Flashcards
Inmunotécnicas para microscopía
inmunoflourescencia
inmunihistoquímica
confocal de fluorescencia
Puede considerarse una inmunotécnica al emplearse un anticuerpo específico contra la proteína de unión al ácido nucleico
EMSA
Antígeno
molécula que induce la formación de al menos un anticuerpo específico
Tiene uno (al menos) o más epítopes
antígeno
Epítope
región de la molécula del antígeno que es reconocida por el anticuerpo, formada por AA
Cómo puede ser un epítope
secuencial/lineal
conformacional/discontinuo
Anticuerpo
proteína sérica conocida como inmunoglobulina que reconoce específicamente a un epítope del antígeno
La región constante (Fc) es…
específica de cada especie
Anticuerpo monoclonal
anticuerpo producido por un solo clon de linfocitos B
Anticuerpos policlonares
mezcla heterogénea de anticuerpos producidos por diferentes clones de células B
Inmunihistoquímica función
para identificar y localizar antígenos (proteínas) en una muestra de tejido
Métodos de la inmunohistoquímica
directo
indirecto
método directo de la inmunohistoquímica
anticuerpo primerio específico para el antígeno que estamos tratando de identificar
acoplado a una enzima
método indirecto de la inmunohistoquímica
anticuerpo primario de una especie en contra del antígeno que se trata de identificar
anticuerpo secundario, contra la Fc de la especie, se obtuvo anticuerpo primerio acoplado a una enzima
Fijación
inmoviliza las células y las preserva
une covalentemente las moléculas proteicas a sus vecinas
Metodología de la inmunohistoquímica
fijación
cortes
incubación con anticuerpo
cromógeno para la enzima
montaje
Indica replicación activa del virus
HBcAg - dentro
HBsAg - fuera
Función de microscopía de fluorescencia
detectar específicamente algunas proteínas u otras moléculas en células y tejidos
Fluorocromo
molécula fluorescente
Esparte del fluorocromo
fluoróforo
Fluoróforo
absorbe la luz de una determinada longitud de onda y emite luz de otra longitud de onda más larga
Método directo de la microscopía de fluoresencia
anticuerpo primario específico para el antígeno (Ag) acoplado a un fluorocromo (F)
Método indirecto de la microscopía de fluoresencia
anticuerpo primario de una especie en contra del antígeno (Ag)
anticuerpo secundario acoplado a un fluorocromo (F)
Método de microscopía de fluorescencia en el que el anticuerpo secundario reconoce la región constante (Fc) de la especie donde se obtuvo del anticuerpo primario
método indirecto
Contratinción
visualización de diferentes moléculas al mismo tiempo en una preparación
La tinción de núcleos se logra con…
DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) o yoduro de propidio
Componentes del microscopio de flurescencia
filtro
espejo dicroico
filtro
1er filtro del microscopio de fluorescencia
deja pasar solamente la luz de cierta longitud de onda
2do filtro del microscopio de fluorescencia
refleja la luz en cierta longitud de onda y se transmite la luz de otra longitud de onda mayor
BrdU
identifica regiones en proceso síntesis activa de DNA
Función del microscopio confocal de fluorescencia
observar una imagen de la arquitectura tridimensional de una célula o un tedjijo
Los métodos electrónicos del microscopio confocaal de fluorescencia permiten…
enfocar un plano de una nuestra eliminando la luz que proviene de las zonas fuera del foco superiores e inferioeres
En el proceso de obtención de secciones finas…
se pierde info respecto a la tercera dimensión
Permite mejor visión de todo a profundidar
confocal
Citometría de flujo
en el rencuentro y clasificación de células por sus caract. morfológicas y presencia de biomarcadores
Características morfológicas
tamaño
granularidad
Presencia de biomarcadores en citometría de flujo
marcados por antucuerpos acoplando
SSC
granularidad
FSC
tamaño celular
Se puede detectar cualquier molécula en la célula, en tanto tengamos …
un anticuerpo específico para ella, acoplado a un fluorocromo
Las células se pueden contar
verdadero
Las células pueden ser incluso separadas y recuperadas
verdadero
Qué provoca la BAJA cantidad de eosinófilos y basófilos
no se definen en base a FSC y SSC
Atraviesa la membrana celular alterada en células muertas y las tiñe
ioduro de propidio
ELISA
permite evaluar a una proteína de manera cuantitativa
ELISA directo
detección de Ag en sangre u orina
el anticuerpo primario debe venir en la muestra
ELISA indirecto
detección de Ag con un solo secundario acoplado a enzima - cambiando el primario o detección de anticuerpos
anticuerpo primario debe venir en la muestra
ELISA sándwich
es más sensible
detección de Ag
unión específica al anticuerpo de captura y al 2do a-Ag es policional
Western Blot
-electroforesis
-transferencia: electrotransferencia y difusión simple o pasiva
-inmunodetección
Función Western Blot
detección mediante un anticuerpo específico, de una proteína dentro de una muestra biológica
Para qué se usa Western Blot
-estimar el tamaño de la proteína (corrimiento electroforético)
-evidenciar isoformas
Estructura de transferencia
esponja
papel filtro
PVDF membrana
Gel
papel filtro
esponja
Comúnmente la proteína blanco está alterada y…
se asume que conserva su función y localización normal
Qué es una etiqueta
secuencia proteica corta que es reconocida fuertemente por un anticuerpo comercial característico
Para qué se emplea la proteína de difusión con una etiqueta de epítopo
inmunofluorescencia
inmunoprecipitación
inmunofluorescencia
el anticuerpo está unido a un fluorocromo
inmunoprecipitación
identificar interacciones funcionales proteína - proteína con proteínas hasta ese momento desconocidas
El complejo proteico puede estar formado por varias proteínas
inmunoprecipatación
Una variante pude ser la purificación del complejo proteico por columna de afinidad …
inmovilizando el anticuerpo en la columna
