Va. Extracción, cuantificación y purificación de AN Flashcards
Primer paso en la tecnología del DNA recombinante
aislamiento del DNA
extracción de DNA genómico
- muestra de células
añadir buffer de lisis para mantener pH, romper membranas, desnaturalizar y degradar proteínas
- muestra de células
- precipitación de proteínas
- precipitación del DNA con alcohol frío y sal
- lavados
- resuspensión en agua libre de nucleasas
-cuantificación y determinación de la pureza
Qué contiene el buffer de lisis
50 mM tris-HCl
pH 8
Buffer para mantener el pH en el cual el DNA se mnntiene estable y con carga negativa
50 mM tris-HCl
1% SDS
detergente aniónico para romper las membranas promoviendo la liberación del DNA
desnaturaliza proteínas
Qué pasa cuando el SDS entra en contacto con la célula
captura los lípidos y las proteínas
Qué es la proteinasa K
una seriana proteasa
Cuando está activa la proteinasa K
bajo condiciones desnaturalizantes
En dónde se encuentra activa la proteinasa K
sobre proteínas nativas y desnaturalizante
Qué inactiva la proteinasa K
RNAsas
DNAsas
Qué incrementa la proteinasa K
la pureza del DNA
la calidad / cantidad de DNA no degradado
Con qué se pueden precipitar las proteínas
con acetona
En la precipitación de proteínas, dónde se encuentra el pellet
en el precipitado
En la precipitación de proteínas, dónde se encuentra el ácido nucleico
sobrenadante
Qué se necesita para la precipitación del DNA
alta concentración de sales
alcohol frío
Neutralizan las cargas negativas de los grupos fosfatos
los iones Na+
En la precipitación del DNA, las moléculas de DNA se juntan o se separan
se juntan
El DNA NO es soluble en …
etanol
Polaridad RNA >
DNA
RNA no precipita
Lavados
etanol al 75% remueve sales e impurezas
NO DISUELVE DNA
Resuspensión del DNA
se solubiliza en agua libre de nucleasas
Coeficiente para la determinación de la pureza
260/280
Pureza DNA óptima
1.8-2
pureza - contaminación con RNA
> 2.1
Método para a extracciín de RNA
método de Fenol-cloroformo
método de Fenol-cloroformo
rompe membranas, desnaturaliza proteínas y libera AN
El RNA permanece disuelto en la fase
acuosa
El DNA menos polar que el RNA se queda entre las fases…
acuosa y fenólica
Pureza RNA óptima
2-2.2
Geles de poliacrilamida
muestras de proteínas
Geles de agarosa
análisis de AN
Cómo está formada la agarosa
b-(1-4)-(3-6)-anhidro-L-galactosa
a-(1-3)-D-galactosa
La agarosa es soluble a una Tem
superior a 65°
Concentración de la agarosa
0.5 a 4%
La movilidad disminuye al…
aumentar el % de agarosa
A menor voltaje…
mayor difusión lateral
A mayor tiempo de corrida…
mayor resolución
Al imcrementar la temperatura…
la movilidad incrementa
Bromuro de etidio
se intercala entre las bases
detecta hasta 1ng de dsDNA
en la agarosa o post-corrida
SYBR
no intercalante
Marcadores de peso molecular
mezcla de moléculas de diferente peso molecular que sirve como referencia para el análisis cuallitativo
En un análisis cualitativo..
NO se puede conocer el # exacto de pb en las bandas
Análisis de retraso en gel permite…
detectar interacciones entre la secuencia esécífica de AN
Mayor resolución empleando un voltaje menor…
mayor tiempo de corrida y % mayor de agarosa
A las cadenas más cortas …
les toma menos tiempo reorientarse y exhiben mayor movilidad
El ángulo de reorientación entre E1 y E2 es…
mayor de 100°
Campos eléctricos no homogéneos
va incrementando
PFGE: 110°-150°
OFAGE: 120°-150°
TAFE: 115°-165°
Campos eléctricos homogénemos
permanece constante
FIGE: 180°
CHEF: 120°
RGE: 120°
Electroforesis capilar
permite resultados en corto tiempo
mínimo consumo de muestra
muy alta resolución
empleada en la secuenciación automatizada
Los grupos silanol en el interior…
se ionizan
El DNA del gen discontinuo…
posee intrones
El cDNA se corresponde…
al mRNA, el cual carece de intrones
