Techniques immunologiques Flashcards
Nommer des interférences analytiques possible pour les immunoessais
- Effet crochet
- Spécificité parfois douteuse (réactivité croisée)
- Auto-anticorps
- Anticorps hétérophiles
- HAMA (human anti-mouse antibody)
- Facteur rhumatoïde
- Biotine
Comment peut-on réduire l’effet interférant des anticorps hétérophiles? (OCQ 2010)
- Dilution de l’échantillon
- Éliminer les Ab interférant avant le dosage
- Ultracentrifugation
- Précipitation au PEG
- Bloquer les Ab interférants de façon spécifique ou non spécifique
- Globulines non-immunes
- Ig anti-Ab hétérophile
- Doser avec un autre immunoessais employant des Ab différents
Donner les avantages/inconvénients pour la néphélémétrie et la turbidimétrie.
(OCQ 2010)
Avantage:
La néphélémétrie est souvent plus sensible et souffre moins d’interférences endogènes que la turbidimétrie.
Inconvénients:
La néphélémétrie est plus $$$ et requiert de l’équipement spécialisé:
- Mesure de turbidimétrie possible dans les multianalyseurs alors que seulement le Vista de Siemens possède l’équipement pour les mesures de néphélémétrie
- Prend beaucoup de place dans le multianalyseur à cause du détecteur placé en angle par rapport au faisceau incident
- Néphélémétrie n’est donc pas toujours disponible
- Détecteur plus sensible requis pour la néphélémétrie
Donner les avantages/inconvénients des dosages immunologiques compétitifs et de types « sandwich ». (OCQ 2010)
Les immunoessais non-compétitifs sont souvent plus spécifiques, plus sensibles et moins susceptibles aux interférences que les immunoessais compétitifs.
Quel est le principe général de la technique de dosage immunologique (immunoessais) ?
Le principe principal de la technologie de dosage immunologique est que la liaison de l’analyte avec une molécule de liaison spécifique doit générer une différence de signal entre l’analyte libre et celui lié.
Quelle est la différence entre un immunoessais homogène et hétérogène?
Homogène : Pas de séparation nécessaire de l’anticorps lié et non-lié pour mesurer le signal
Hétérogène : Anticorps lié doit être séparé de l’anticorps non-lié pour mesurer le signal
Quel est le principe général d’un immunoessais compétitif? Nommer un exemple d’immunoessais compétitif
Principe d’un immunoessais compétitif:
- Ajout d’une quantité prédéterminée d’anticorps et d’antigène marqué (Ag*) à l’échantillon.
- L’analyte à doser compétitionne avec Ag* pour lier l’anticorps.
- Le signal est produit à partir de la molécule marquée
- Si le signal est produit par Ag* lié à l’anticorps : Inversement proportionnel à [analyte]
- Si le signal est produit lorsque l’analyte est lié à l’anticorps (Ag* libre) : Directement proportionnel à [analyte]
Exemples d’immunoessais compétitifs :
- EMIT : compétitif homogène, signal directement proportionnel à la concentration d’analyte
- CEDIA : compétitif homogène, signal directement proportionnel à la concentration d’analyte
- Électrochimiluminescence (ECL/ECLIA/CLIA) : compétitif quasi-hétérogène, signal inversement proportionnel (si le signal provient de l’Ag lié à l’Ab)
Décrire les principes pour la néphélométrie et la turbidimétrie. (OCQ 2010)
Turbidimétrie :
- Mesure de la turbidité de l’échantillon
- Turbidité créée par des particules de latex liées à un Ag (compétitif) ou à un Ab (non-compétitif)
- Mesure de la réduction de la transmittance (augmentation de l’absorbance) proportionnelle à la turbidité qui augmente
- Mesure en point final ou en taux turbidimétrique
Néphélométrie:
- Mesure de la lumière diffusée (à 90° ou vers l’avant) par rapport au faisceau incident
- Utilisation d’Ab ou d’Ag lié à des particules de latex
- Compétitif : Ag lié à des particules
- Non-compétitif : Ab lié à des particules
- Signal inversement ou directement proportionnel selon si compétitif ou non-compétitif
Quel est le principe d’un immunoessais non-compétitif LOCI?
LOCI : Luminescent oxygen channeling immunoassay
- Utilisation d’un Ab marqué avec la biotine et d’un Ab associé à une particule chemiluminescente
- Formation de la sandwich lors de l’ajout de l’échantillon
- Ajout d’une particule photosensible liée à la streptavidine. Liaison Streptavidine-Biotine
- Excitation de la particule photosensible à l’aide de la lumière, production d’O2 singulet
- L’O2 singulet active la particule chimiluminescente qui émet un signal lumineux
Immunoessais non-compétitif (sandwich), homogène et dont le signal est directement proportionnel à la concentration de l’analyte
Ex: dosage prolactine
Quel est le principe d’un immunoessais compétitif LOCI?
LOCI : Luminescent oxygen channeling immunoassay
- Utilisation d’un Ab marqué avec la biotine
- Liaison de l’Ab et de l’analyte à doser
- Ajout d’un Ag associé à une particule chemiluminescente (Ag*). Liaison des Ab libres résiduels
- Ajout d’une particule photosensible liée à la streptavidine. Liaison Streptavidine-Biotine
- Excitation de la particule photosensible à l’aide de la lumière, production d’O2 singulet
- L’O2 singulet active la particule chimiluminescente qui émet un signal lumineux seulement lorsque les particules sont étroitement liées via la liaison Ab-Ag*
Immunoessais compétitif, homogène et dont le signal est inversement proportionnel à la concentration de l’analyte
Ex: dosage FT4
Quel type d’immunoessais utilise le principe suivant :
Compétition entre l’analyte et un Ag couplé à une enzyme. Le signal est produit lorsque l’Ag couplé à une enzyme n’est pas lié par l’Ab.
Le signal est-il directement ou inversement proportionnel à la concentration de l’analyte?
EMIT : Enzyme-multiplied immunoassay technique
Signal directement proportionnel (plus il y a d’analyte, plus l’Ag* est libre, donc plus le signal est intense)
Nommer les principales différences entre les méthodes de dosage EMIT, CEDIA et ELISA.
Points communs :
- EMIT, CEDIA et ELISA sont tous des immunoessais enzymatiques (EIA)
- Le signal mesuré est directement proportionnel pour tous ces types d’immunoessais. Cependant, les mécanismes de production du signal sont différents
Différences :
- ELISA :
- Non-compétitif (sandwich)
- Hétérogène
- Enzyme liée à l’Ab de détection
- Signal produit lorsque la sandwich est complète
- EMIT :
- Compétitif
- Homogène
- Enzyme lié à un Ag
- Signal produit lorsque l’Ag lié à l’enzyme est libre (non lié à un Ab)
- CEDIA :
- Compétitif
- Homogène
-
2 fragments d’enzymes inactifs qui produisent une enzyme active lorsqu’ils sont reliés
- 1 fragment est lié à un Ag
- La liaison de l’Ab à l’Ag contenant le fragment d’enzyme empêche la formation de l’enzyme active
Donner un exemple d’application courante pour chacun des types d’immunoessais suivant: ELISA, CEDIA, EMIT, LOCI, ECLIA
ELISA: Détection d’anticorps (Ex: varicelle, rubéole), calprotectine fécale, Ab anti-récepteur de phospholipase A2
CEDIA: drogues urinaires en général (Microgenics, Thermo Fisher)
EMIT: Amphétamines, metamphétamines (drogues urinaires en général)
LOCI: FT4, prolactine, TSH, … (Siemens)
ECLIA : Vitamine B12, T3L, cortisol, LH (Roche Elecsys)
Décrire le phénomène d’excès d’antigène
Excès d’antigène = effet crochet
- Lorsque l’analyte est en trop grand concentration, que les Ab sont complètement saturés et que le signal produit est sous-estimé dû à la saturation du système de détection
- Résultat : faux négatif
Comment les HAMA peuvent interférer dans un immunoessai?
- Les HAMA sont des Ab endogènes humain anti-souris développés à la suite d’une exposition à des Ag de souris
- Les HAMA peuvent reconnaitre les Ab de souris utilisés dans les immunoessais pour produire le système de détection
- Affinité élevée et spécifique pour les Ab murins
- Neutralisation des Ab de l’immunoessais
- Effet variable selon architecture de l’immunoessais
- Non-compétitif (sandwich) : diminution du signal (Faux négatif)
- Compétitif avec signal produit par un Ag* lié à l’Ab : diminution du signal (Faux négatif)
- Compétitif avec signal produit par un Ag* libre : augmentation du signal (Faux positif)
Décrire le principe, les avantages et désavantages de la néphélométrie?
Principe :
- Utilisation d’Ab liés à des billes de latex spécifiques pour l’analyte à doser
- Lorsque l’analyte est reconnu par les Ab, formation d’aggrégats
- Plus il y a d’aggrégats (turbidité), plus la lumière sera diffusée.
- Le signal provient de la mesure de la lumière diffusée à un angle de 90° (ou vers l’avant) par rapport au faisceau incident
(!) Méthode aussi disponible avec des Ag marqués avec des billes de latex. Principe d’inhibition de la turbidité (compétitif)
Décrire les principes des dosages immunologiques compétitifs et de types « sandwich ».
Donner aussi un exemple de paramètre mesuré par chaque approche. (OCQ 2010)
Compétitif:
- Compétition entre un antigène marqué et l’analyte pour un anticorps spécifique
- Le signal est inversement proportionnel s’il provient de l’Ag lié ou directement proportionnel s’il provient de l’Ag libre
- Souvent utilisé pour les petites molécules (Ex: drogues dans les urines)
- Ex: cocaïne urinaire, amphétamines, THC
Non-compétitif (sandwich) :
- Utilisation de 2 anticrops spécifiques pour l’analyte à doser : 1 Ab de détection et 1 Ab de capture
- Signal directement proportionnel à l’analyte
- Souvent utilisé pour les grosses molécules (Ex: protéines, peptides, hormones)
- Prolactine, TSH, FSH, myoglobine, THIN
Discuter de l’effet matrice
Interférant endogène qui interfère de façon non-spécifique
Ex: hémoglobine, bilirubine, lipides, paraprotéines
Discuter de la réactivité croisée dans les immunoessais
Lorsque des molécules endogènes ou exogènes réagissent avec les composantes réactionnelles pour former un complexe Ag-Ab détectable qui s’apparente au complexe principal attendu (analyte-Ab)
Discuter des interférences analytiques causées par les anticorps hétérophiles lors d’une analyse par immunoessais
Anticrops hétérophile :
- Ab humain endogène qui réagit avec les composantes réactionnelles de l’immunoessais
- Produit des résultats erronés
- Faux positif ou faux négatif en fonction de comment le signal est produit et des composantes neutralisées
Vrai ou Faux : Les interférences causées par les anticorps hétérophiles sont retrouvées principalement lors des dosage de sang, sérum, plasma et urine.
FAUX
Beaucoup moins fréquent dans l’urine. Il faudrait un patient en insuffisance rénale terminale avec production d’Ab hétérophile pour observer cette interférence sur les échantillons d’urine. (Anecdotique!)
Que sont les anticorps hétérophiles? (OCQ 2010)
Anticorps hétérophiles : Ab humains qui interagissent avec les composantes réactionnelles de l’immunoessais (Analyte, Ab ou Ag*).
Différents types d’Ab hétérophiles:
- Ab hétérophiles qui intéragissent de façon non spécifique et faiblement avec Ab de l’IE
- Auto-Ab vs l’analyte (spécifique)
- Ab anti-animal (interaction spécifique et forte avec Ab de l’IE)
- Macro-analyte, macro-enzyme
- Facteur rhumatoïde
D’où proviennent les anticorps hétérophiles? (OCQ 2010)
Des anticorps hétérophiles peuvent apparaître chez un patient en réponse à une exposition à certains animaux ou produits animaux (Ex: Tx avec Ab), ou à une infection par des agents bactériens ou viraux, ou de manière non spécifique (Ex: maladie auto-immune).
Différents types d’Ab hétérophiles:
- Ab hétérophiles qui intéragissent de façon non spécifique et faiblement avec Ab de l’IE
- Auto-Ab vs l’analyte (spécifique)
- Ab anti-animal (interaction spécifique et forte avec Ab de l’IE)
- Macro-analyte, macro-enzyme
- Facteur rhumatoïde
Pourquoi les HAMA sont-ils aussi répendus ?
À cause de l’utilisation fréquente d’Ab monoclonaux de souris dans le cardre de thérapie ou d’imagerie
