Manipulación de genes: ELISA Flashcards
¿Qué es ELISA?
Test inmunológico muy sensitivo
¿Para qué se utiliza ELISA?
Para la detección y ciuantificación de:
- Anticuerpos
- Antígenos
- Proteínas
- Glucoproteínas
- Hormonas
Proteína elaborada por las células plasmáticas en respuesta a un antígeno
Anticuerpo
¿A qué se une un anticuerpo?
A un solo antígeno específico
¿Qué tipo de anticuerpos se utilizan?
De origen monoclonal
Anticuerpo
Molécula ajena o tóxica para el organismo que, una vez dentro del cuerpo, induce en este una respuesta inmunitaria
Antígeno
¿Qué provocan los antígenos dentro del cuerpo?
Formación de anticuerpos
¿Cómo se logra realizar un ELISA?
Realizando complejos antígeno-anticuerpo
¿Qué se requiere para realizar un ELISA? (4)
- Anticuerpos primario y/o secundario
- Antígeno
- Buffer
- Cromogeno o sustrato
Pasos generales para realizar un ELISA (4)
- Recubriemiento
- Bloqueo
- Detección
- Lectura final
¿Con qué se hace el recubriemiento?
Con un antígeno o anticuerpo
¿Con qué se hace normalmente el bloqueo?
Con la adición de albúmina de suero bovino [BSA]
¿Para qué sirve el bloqueo?
Para evitar que en las incubaciones se unan a la placa, de forma inespecífica otras moléculas que podrían interferir con los rescultados
Tipos de ELISA (3)
- ELISA directo
- ELISA indirecto
- ELISA sandwich
ELISA directo
ELISA indirecto
ELISA sandwich
Pasos de ELISA directo
- Fijación del antígeno a la placa -> la placa se incuba -> lavado de la placa
- Bloqueo de la placa (rellenar los huecos que no fueron cubiertos por el antígeno) -> se añade la proteína bloqueante -> incubar -> eliminar sobrenadante -> lavado de placa
- Incubación con el conjugado -> se añade el conjugado (reconoce directamente al antígeno que se busca) -> incubar (conjugado + antígeno) -> si el conjugado reconoce al antígeno, tras la incubación se habrán formado inmunocomplejos que quedan inmovilizados en la placa -> retirar el sobrenadante y conjugado libre -> lavar la placa
- Incubación con el substrato/cromógeno -> añadir mezcla de substrato/cromógeno -> incubar (el sustrato se rompe) -> cromógeno cambia de color -> parada de reacción (añadir ácido para neutralizar)
Reacción positiva: color amarillo pálido a marrón
Pasos para ELISA indirecto
- El antígeno se inmoviliza sobre una placa
- Se añade un anticuerpo primario sin marcar que se une al antígeno de interés
- Se añade un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo primario
- Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una luz visible
- Detecta y/o cuantifica el antígeno de interés
Pasos para ELISA sandwich
- El anticuerpo de captura se inmoviliza
Pasos para ELISA sandwich
- El anticuerpo de captura se inmoviliza
- Se añade la muestra que contiene el antígeno de interés que se unirá al anticuerpo
- Se añade el anticuerpo de detección que se unirá al antígeno unido a su ves al anticuerpo de captura
- Se añade un anticuerpo secundario marcado que se unirá al anticuerpo de detección
- Se añade el sustrato y se proporcionará una señal visible
- Detección y/o cuantificación del del antígeno
ELISA directo
ELISA indirecto
ELISA sandwich
Uso diagnóstico de ELISA directo
Analizar la respuesta inmune frente a un determinado antígeno
Características de ELISA directo
- Menor sensibilidad
- Mayor ruido de fondo
¿Por qué hay mayor ruido de fondo en ELISA directo?
Porque las proteínas de las muestras y los antígenos se quedan en el fondo
Uso diagnóstico de ELISA indirecto
Determinar la concentración total del anticuerpo en una muestra
Características de ELISA indirecto
- Alta sensibilidad
- Procemiento muy largo
- Posible reacción cruzada
Usos diagnósticos de ELISA sandwich
Análisis de muestras complejas
Características de ELISA sandwich
- Alta especificidad
- Alta sensibilidad
Tipo de ELISA más simple y rápido
ELISA directo
¿Por qué ELISA directo tiene un uso limitado?
Por su menor sensibilidad y la dificultad para obtener un conjugado que reconozca directamente al antígeno
¿Para qué sirven los controles?
Para saber que la muestra se realizó correctamente
