Geneeskunde 2A1 HC week 3 - 18/9 Flashcards
Uit welke componenten bestaat het humane genoom?
- Nuclear genome (kern-DNA): 16,5 kilobasenparen, maximaal 1000 kopieën per cel, <1% van het totale DNA, circulair
- Mitochondrial genomes (mitochondriaal-DNA): 3 miljard basenparen lang (haploïd), 50-250 Mb per chromosoom (1,7-8,5 cm lang)
Hoe wordt de sequentie van het menselijk genoom bepaald?
- Isoleren DNA
- Kloneren DNA (m.b.v. bacteriën)
- Delen van het DNA ordenen op plekken van het chromosoom
- Specifiek deel van het DNA in kleine stukjes knippen
- Sequencen van kleine stukjes DNA, waarna ze weer in de goede volgorde gezet worden (overlap op strengen)
Wat zijn de volgende aantallen:
1. Aantal eiwit coderende genen in het genoom
2. Aantal RNA-only genen
3. Percentage dat bestaat uit coderende sequenties
4. Percentage dat bestaat uit hoog repetitief DNA afkomstig van transposable elementen (elementen die toevallig in het genoom zijn gekomen) ?
- 19.831 genen (1,5x zoveel als fruitvlieg, 3x zoveel als bakkersgist –> proteoom is wel veel complexer dan dat van intervertebrale organismen)
- 25.959 genen (functie niet volledig opgehelderd)
- 1,5% (omdat meeste delen veel/grote intronen bevatten wordt ten minste 33,3% wel getranscribeerd)
- 50% van het genoom (transposon activiteit bijna helemaal verloren, daarom op een vaste plek blijven zitten)
Hoe erg is het humane genoom gelijk met dat van andere zoogdieren?
DNA-verschil tussen 2 mensen: 1 verschil per 1000 basen (SNP) = 0,1% (zo’n 3 miljoen basenparen)
DNA-verschil tussen mens en chimpansee: 1 verschil per 100 basen = 1%
–> disclaimer: grootte genoom bepaald niet complexiteit van het organisme
Waarbij wordt humane genoomsequentie toegepast?
- Identificeren en kloneren van ziektegenen (inc. oncogenen zoals BRCA2 en XLP)
- Identificeren van nieuwe genen die verwant zijn aan bekende drug targets (mogelijkheid nieuwe farmacologische stoffen te ontwikkelen/oude te verbeteren)
- Vinden van mutaties die overgevoeligheid voor medicijnen veroorzaken (hierdoor dosis aanpassen en risico bijwerkingen terugbrengen)
Hoe verloopt een cDNA microarray?
Door combinaties van bepaalde regulatie-eiwitten met cellen ontstaan verschillende soorten celtypen (400 verschillende in het lichaam) –> te onderscheiden door naar genexpressie in celtypen te kijken
Microarray:
1. Isoleren RNA uit tumor en gezond weefsel
2. Analyse m.b.v. microarray analyse, 3 opties:
* Geen oplichting: geen genexpressie
* Gele uitslag: genen even hart tot expressie in beide weefsels
* Groene/rode uitslag: genen komen in het gezonde weefsel meer tot expressie dan in het tumor weefsel (groen) of andersom (rood)
3. Data analyseren m.b.v. bioinformatica
4. Validering van microarray analyse: m.b.v. western blot of PCR
5. Inzicht in genen en moleculaire processen (–> voor diagnose, prognose en individuele behandeling te verbeteren)
Waarom is microarray belangrijk bij DLBCL (diffuse large B cell lymphoma)?
DLBCL: grote laesies op de huid
- M.b.v. cDNA microarray kan onderscheid worden gemaakt tussen 2 vormen (germinal centre B-like DLBCL, activated B-like DLBCL), deze hebben een hele andere prognose waardoor ook de behandeling anders ingesteld kan worden
Hoe wordt Next Generation Sequencing (NGS) toegepast?
Voor €1000 het complete genoom van een individu sequencen
- genoom individu vergelijken met referentiegenoom: varianten in eiwit coderende exonen, varianten die genexpressie beïnvloeden en genduplicaties, kleine deleties en inversies in kaart brengen
- gebruikt voor het voorspellen van eigenschappen: oogkleur, ziekterisico, verslaving
- ong. 44% v.d. genen zijn heterozygoot voor 1/meerdere varianten (invloed op het eiwit wat het codeert)
- in de praktijk: opsporen mutaties, sequensen RNA om genexpressie profielen te bepalen, mRNA sequensen
Welke informatie kan er in de praktijk uit een NGS gehaald worden?
- dynamisch bereik (moleculen tellen)
- gebruik alternatieve promotoren onderzoeken
- alternatieve splicing onderzoeken
- allel-specifieke genexpressie onderzoeken
- mutaties detectie
- ontdekken van nieuwe exons, niet-coderend RNA en microRNA
Wat is proteomices?
Techniek waarmee je de eiwitten van een cel kunt bestuderen
- hoeveelheid (actie) eiwit is een betere maat voor genexpressie dan mRNA
- op basis hiervan een expressieprofiel van eiwitten maken (kost tijd, maar met verbeterde technieken mogelijk
- mogelijkheden voor analyse: eiwitidentificatie, eiwitmodificatie, eiwit-interacties tussen eiwitten
Hoe verloopt de eiwit identificatie m.b.v. een massaspectometrie?
- Een mengsel van eiwitten in kleine stukjes knippen m.b.v. trypsine (protease uit de darmen, knipt voor een arginine (R) of lysine (K))
- Kleine stukjes eiwitten (peptiden die beginnen met K of R –> tryptische fragmenten) analyseren op massa
- Analyse vergelijken met wat men verwacht a.d.h.v. het genoom –> eiwit identificeren
Hoe analyseert een massaspectometrie de massa van een eiwit?
- Op de massaspectometer (lange buis met een plaat) wordt het eiwitmengsel aangebracht
- Plaat wordt met een laser geschenen
- Eiwitten worden positief geladen doordat elektronen wegschieten
- Positief geladen peptiden gaan bewegen richting de negatieve pool –> snelheid is afhankelijk van de grootte (kleiner = sneller)
- Peptiden worden geregistreerd als ze langs de detector plaat komen en hier kan de molecuulmassa (op meerdere cijfers achter de komma, anders kun je niet het aantal aminozuren berekenen) en relatieve hoeveelheid van het eiwit aangeduid worden
Hoe kun je m.b.v. een massaspectometrie de structuur van een eiwit achterhalen?
Zie afbeelding!
Uit de massaspectometrie komt een lijst van molecuulmassa’s die in het sample zaten, m.b.v. een computer maak je van alle mogelijke eiwitten een lijst van alle mogelijke tryptische fragmenten en bereken je hier de molecuulmassa’s van
–> neem je deze gegevens samen dan kun je de eiwitten identificeren
Wat kan een massaspectometrie m.b.t. eiwitten?
- Eiwitten identificeren
- Eiwitten kwantificeren (iets moeilijker)
- Bindende eiwitten identificeren
- Eiwitmodificaties identificeren (fosforylering, acetylering, methylering, etc.)
Hoe identificeer je m.b.v. een massaspectometrie welke eiwitten binden aan het eiwit van interesse?
- Aan het mengsel een antilichaam voor het eiwit naar interesse toevoegen
- Eiwit van interesse (met andere gebonden eiwitten) zal aan het antilichaam binden
- Eiwitten die niet hebben gebonden wegwassen
- M.b.v. een massaspectometrie de eiwitten in kaart brengen en de eiwit-interacties ophelderen
–> kan voor verschillende eiwitten, ook meer duidelijkheid over complexe regulatie circuits in cellen (gebruikt om genexpressie profielen te begrijpen)
Hoe kun je m.b.v. metabolieten eiwitten analyseren?
Metabolieten als suikers, nucleotiden, aminozuren en vetten komen in het bloed, maar worden gemaakt door cellen en zo is te achterhalen wat er in de cellen gemaakt wordt
- aanwezigheid van bepaalde metabolieten kan mogelijk worden gebruikt in de vroege detectie van tumoren
Hoe breng je een metaboloom in kaart?
- Sample preparation
- Massaspectometrie
- Identificatie m.b.v. een computer
- Herkennen van een patroon
- Bepalen van de biomarker
Hoe wordt de translatie van mRNAs gereguleerd?
Op het DNA liggen genen die niet coderen voor eiwitten maar voor kleine stukjes RNA (microRNA) die de translatie van mRNA beïnvloeden, dit gebeurt in de volgende stappen:
1. Van DNA wordt een stuk RNA afgeschreven: primair micro-RNA (miRNA)
2. Drosha (enzymcomplex) knipt het tot pre-miRNA
3. Transport vanuit nucleus naar cytoplasma
4. Dicer knipt het complex tot miRNA (kort dubbelstrengs RNA)
5. 1 streng wordt ingebouwd in het RISC-complex
6. RISC-complex bindt aan een complementaire sequentie in het mRNA (meestal 3’)
7. miRNA zorgt voor specificiteit, binding vermindert de translatie van dat stuk RNA of zorgt voor meer mRNA afbraak
–> 1 miRNA kan soms binden aan verschillende mRNAs en zo meerdere eiwitten reguleren
Wat is het belang van microRNA voor kanker?
- bijna de helft van het microRNA-onderzoek richt zich op kanker; soms beïnvloed miRNA direct de expressie van kanker-gerelateerde genen
–> bijv. miRNA-16: miRNA16 komt verlaagd tot expressie in een aantal tumoren –> hierdoor zal BCL2 verhoogd zijn (–> apoptose remmen) en CDC25A verhoogd zijn (–> celcyclus progressie) –> samen leidt dit tot groei van kanker - het analyseren ervan geeft een goede prognostische en diagnostische waarde
- i.c.m. mRNA microarray/sequencing, protemics en metabolomics krijg je veel informatie, echter is het wel erg duur
Hoe worden korte RNAs (siRNAs) gebruikt in onderzoek?
Stukje RNA die je zelf in het genoom kunt inbrengen en hierdoor mRNA kan afbreken waartegen het gericht is
- Zodra dubbelstrengs RNA de cel inkomt, knipt het enzym dicer in korte stukjes (siRNA)
- Deze kunnen worden ingebouwd in het RISC-complex
- RISC-complex zal het dubbelstrengs-RNA in stukken gaan knippen
–> echter in de praktijk voor de therapie nog niet mogelijk om dit toe te passen (wel in het laboratorium)
Hoe werkt RNA-interferentie (RNAi) en wat zijn de voor- en nadelen?
Principe:
1. Een hele hoop stukjes siRNAs verzamelen in een aparte celkweek
2. In elke celkweek een specifiek eiwit uitschakelen
3. Effect van de behandeling analyseren
4. Kijken welke siRNAs celdood voor kankercellen geven, maar niet voor normale cellen
5. Controleren of er al remmers voor deze targets zijn
6. Controleren of de remmer daadwerkelijk werkt in cellen/diermodellen
Voordelen: voorkomen dat eiwitten die essentieel zijn voor de groei van kankercellen tot expressie komen, eenvoudig toe te passen op elk willekeurig gen waarvan men de sequentie weet (zeer specifiek), niet snel resistentie, geschikt voor hoge doorvoer analyses
Nadelen: alleen gebruikt om expressie te remmen, niet bekend hoe het in de gewenste cellen ingebracht wordt (heel misschien hiervoor virussen gebruiken –> onderzoek in DLBCL)
