Belangrijkste flashcards 2A1 (t/m week 5)
Wat is de definitie van kanker?
Abnormale celgroei buiten de gewoonlijke anatomische grenzen
- mogelijkheid om omliggende structuren/organen te invaderen en/of te verspreiden naar verder gelegen organen
Wat zijn prognostische en predictieve factoren van (bio)markers?
- Prognostisch: heeft een waarde in het natuurlijk beloop van de ziekte (aanwezigheid van een eiwit beïnvloed het natuurlijk beloop)
- Predictief: voorspelt de kans op succes/falen van een bepaalde behandeling (aanwezigheid van een eiwit beïnvloed of een bepaalde behandeling mogelijk is)
Kunnen beide positief of negatief zijn
Wat is de calculus van leed en het ethische dilemma in de medische wetenschap?
We leggen niet alleen de nadruk op niet-schaden, maar ook nadruk op weldoen (risico’s afwegen tegen de voordelen)
–> hierdoor is medisch onderzoek mogelijk, met het dilemma:
Vooruitgang in de medische wetenschap (kan zorgen voor gezondheidswinst)
VS
Beschermen van proefpersonen (tegen risico’s en bezwaren van onderzoek)
Wat gebeurt er bij leukemie?
Stamcellen hebben een verhoogde celdeling, maar geen uitrijping –> hierdoor ophoping van onrijpe leukemische cellen die de normale bloedaanmaak kwaadaardig verstoren
- Lymfatisch of myeloïde, acuut of chronisch
- Symptomen door anemie, neutropenie, trombopenie, hyperleukocytose, hepatosplenomegalie, extramedullaire lokalisatie en toxische stoffen
- Onderzoek: cytomorfologie, immunologie, moleculaire diagnostiek, cytogenetica (+ biobanking)
Wat is het doel van chemotherapie en immunotherapie?
- Klachten bestrijding (vaak chemo)
- Levensverlenging (vaak chemo)
- Genezing (immuuntherapie (stamceltransplantatie))
Verschil acute vs. chronische leukemie?
Zie tabel!
Ook AML:
- Heterogene ziekte: verschillende mutaties (en combinaties hiervan) veroorzaken de ziekte –> beloop verschilt hierdoor enorm –> patiënten o.b.v. mutatie onderverdelen in subtypes
Verschil myeloïde vs. lymfatische leukemie?
Wat zijn de 3 opeenvolgende mutaties bij leukemie en met welke techniek kun je deze gemakkelijk vinden?
Next generation sequencing (NGS): relatief makkelijk in veel patiënten naar veel mutaties kijken, afwijkingen die het ontstaan, beloop of behandeling beïnvloeden, verschil tussen:
- driver mutaties: hierdoor ontwikkeling tot een leukemische stamcel
- subclonale (cluster) mutaties: buiten driver mutaties nog meer mutaties, bij een recidief altijd kijken welke cluster mutatie hiervoor verantwoordelijk was
- recidief (relapse) mutaties: nieuwe mutaties in cluster mutaties
Wat zijn de 10 hallmarks of cancer?
Verzameling dingen die gebeuren van normale cel tot kankercel, niet elke kankercel hoeft aan alle hallmarks te voldoen:
1. Blijven delen: normaal groeifactoren via groeifactor receptor nodig, bij een tumorcel zelf groeifactor aanmaak of dit niet nodig voor activering (gaspedaal)
2. Remming ontwijken: normale cellen luisteren naar signalen die de groei remmen, een tumor schakelt deze groeiremmers uit
3. Celdood weerstaan: normale cellen activeren mechanismen die tot celdood leiden (apoptose), tumoren schakelen deze processen uit
4. Oneindige celdeling: normale cellen hebben een beperkte delingscapaciteit (doordat telomeren uiteinden korter worden), een tumor schakelt telomeer verlenging in (zoals in stamcellen) m.b.v. telomerase (brandstoftank)
5. Vorming van nieuwe bloedvaten: angiogenese, een groeiende tumor heeft veel voedingsstoffen nodig dus creëert een omgeving ondersteunend aan zijn groei
6. Invasie en metastase: invasie bij binnendringing van omringend weefsel met doorbraak van basaalmembraan, bij transport van tumorcellen en een nieuwe tumor spreek je van een metastase
7. Genoom instabiliteit en mutaties: eerst ophoping van mutaties voordat een tumorcel problemen oplevert, bij tumoren problemen in DNA-reparatiemechanismen –> hierdoor makkelijker mutaties
8. Deregulatie van energievoorziening: tumorcellen leven van glycolyse en zetten pyruvaat om in lactaat, hierdoor overleving in zuurstofarme perioden
9. Tumor bevorderende ontsteking: chronische ontstekingen zijn tumor bevorderend, immuuncellen ((M2)macrofagen en granulocyten) breken stroma af (afvalproduct als voedingsstof en productie groeifactoren) en bouwen het weer op
10. Ontsnapping aan het immuunsysteem: tumoren activeren mechanismen die het immuunsysteem minder actief maken (bijv. downregulatie van HLA-eiwitten)
Wat is stroma?
Ontstaat vanaf de angiogene switch: directe omgeving naast de tumor die de tumor ondersteund en angiogenese stimuleert
- meer aanbod groeifactoren (HIF1-alfa, VEGF, VEGF-R)) en minder groeiremmende factoren
- Ondersteunend, niet-neoplastisch bindweefsel ((fibroblasten, endotheelcellen)
- Bloedvaten
- Ontstekingscellen
Uit welke stappen bestaat het proces van metastasen (bij een epitheliale tumor)?
- Invasie: migratie door basaalmembraan (detachment)
- Invasie: verplaatsing door extracellulaire matrix
- Metastase: intravasatie (binnendringen van bloedvat) (EMT = epetheliale mesenchymale transitie (afbraak stroma voor tumorverplaatsing naar bloedvat) –> o.i.v. TWIST, SNAIL, SLUG, ZEB1)
- Metastase: transport in de bloedbaan (als tumor embolus) (of via de lymfeklieren)
- Metastase: extravasatie en metastatic deposit
- Metastase: kolonisatie en uitgroei (MET = mesenchymale epitheliale transitie (uitgroei op de plek van metastase))
–> Dormancy fase: EMT-MET is multistep proces wat onderbroken kan worden –> groei staat stil en tumorcellen kunnen zich in niches schuilhouden en na 10-20 jaar pas verder ontwikkelen
Hoe en waar vind de bloedcelvorming plaats?
In de platte botten in het beenmerg, organen, lymfeklieren en thymus
- alles ontstaat uit 1 type stamcel, pluripotente stamcel; verschillende typen nakomelingen, hoeveelheid delingen laag, asymmetrische zelfvermeerdering, ongevoelig genotoxische invloeden, lang termijn herstel beenmerg
- na differentiatie vorming van voorlopercellen: weinig zelfvermeerdering, uni-/multipotent (weinig bloedceldifferentiatielijnen), hoge delingsfrequentie maar lage -potentie, gevoelig genotoxische invloeden, kort termijn herstel beenmerg en bloed
- differentiatie door hematopoiëtische groeifactoren; EPO (erytrocyten), G-CSF (leukocyten) en TPO (trombocyten)
– aanwezigheid van onrijpe myeloïde cellen (blasten en promyelocyten) of lymfoïde cellen (lymfoblasten) wijzen op leukemie
Welke 3 manieren zijn er om de overleving te bekijken?
- Absolute overleving (overall): tijd tussen diagnose en sterfte, ongeacht doodsoorzaak
- Ziektevrije overleving (disease-specific): tijd tussen diagnose en progressie van de ziekte
- Relatieve overleving (relative): maat voor ziektevrije overleving, cijfer van absolute overleving gecorrigeerd voor leeftijd, geslacht en jaar van diagnose
Soorten puntmutaties en chromosomale afwijkingen?
Puntmutaties
- Transitie: base veranderd (A/G of C/T)
- Transversie: overgang plaats van een purine (A/G) naar een pyrimidine (C/T) of andersom
* Missense mutatie: aminozuurverandering in een eiwit
* Nonsense mutatie: codon omgezet in stopcodon
- Deletie: verwijderen 1/meerdere basen
- Insertie: toevoeging 1/meerdere basen
Chromosomale veranderingen:
- Translocaties: uitwisseling van chromosoomstrengen
- Amplificaties: vermeerdering van de mutatie - Deleties: stukken DNA verloren door breuken binnen een chromosoom
- Numerieke afwijkingen: te veel/weinig kopieën van een chromosoom (aneuploïde)
- Inversie: stuk chromosoom is 180 graden gedraaid (aan P- (korte) of Q-arm (lange) = paracentrisch, of rondom centromeer = pericentrisch)
- Insertie: interstitieel stukje verplaatst
Wat zijn de 5 oorzaken van DNA-beschadigingen?
- Chemische instabiliteit: spontane hydrolyse en deaminatie van basen
- Chemische verbindingen
- Biologische stoffen: endogene stoffen (zuurstofradicalen) en benzo[a]pyreen (in sigarettenrook)
- Fysische agentia: ontstaan pyrimidine dimeer en 6-4 fotoproduct
- Foutieve replicatie
Wat zijn de 5 verschillende soorten DNA-beschadigingen en de mechanismen om het te verhelpen?
- Chemische adducten: DNA-dubbele helix verstorend –> NER en -niet-verstorend –> BER
- Intrastrengs crosslinks: UV-licht of cisplatine –> NER
- Interstrengs crosslinks: 2 guaninen uit aparte strengen aan elkaar –> BER
- DNA-streng breuken: enkelstrengse (oxidatieve DNA-schade) –> BER of dubbelstrengse breuk (ioniserende straling) –> NHEJ of HR
- Basepaar mismatches: translesie synthese of proofreading fouten –> mismatch reparatie (MMR)
Welke 2 DNA-schade reparatiemechanismen zijn er?
- Base Excisie Reparatie (BER)
- Herkenning: DNA glycosylase maakt abasische plaats
- Excisie: AP-endonuclease maakt enkelzijdige breuk 5’-kant van AP
- Herstel: Long patch (DNA-polymerase bindt, bouwt nieuwe nucleotiden in en na synthese overig deel door endonuclease weggeknipt, lijmen door ligase) en Short patch (breuk 3’-kant door dRP lyases, DNA-polymerase en ligase maken het gat dicht) - Nucleotide Excisie Reparatie (NER)
- Herkenning: Globaal genoom NER of Transcriptie gekoppelde NER zorgt voor binden van transcriptiefactor IIH
- Excisie: helicase ontwindt DNA, knip aan 3’-kant door XPG (20-30 moleculen weg) –> DNA-polymerase complex naar achter naar mutatie
- Herstel: DNA-polymerase synthetiseert en ligase lijmt het gat
Hoe verloopt herstel van dubbelstrengs DNA-breuken door niet homologe DNA eindverbinding en homologe recombinatie?
Niet homologe DNA eindverbinding: onnauwkeurig
1. KU70/80 eiwit herkent een breuk in DNA
2. Complex van 4 eiwitten wordt opgebouwd
3. Ligase bindt en zet het DNA weer aan elkaar vast
4. Celdeling gaat door ten koste van nauwkeurigheid in DNA-code
Homologe recombinatie:
1. Enzymen (RAD51) gaan van het dubbelstrengs uiteinde een enkelstrengse staart maken –> van de 5’ kant wordt DNA ‘weggegeten’ waardoor een staart aan de 3’ kant ontstaat
2. Staart (met RAD51) op zoek naar identieke zusterchromatide (base pairing)
3. DNA-synthese plaats van de missende delen en ligatie van de begroken strengen
4. Resolutie van de verbonden zusterchromatiden plaats
Welke 3 mechanismen zijn er om ervoor te zorgen dat DNA-replicatie nauwkeurig verloopt?
- Base selectie: m.b.v. katalytisch centrum is DNA-polymerase in staat te bepalen welke nucleotide moet worden ingebouwd, hij wordt eerst gepast voordat het covalent wordt gebonden aan de primer (nauwkeurigheid 1 op 1000)
- Proofreading: heel soms vindt er protonverplaatsing plaats (tautomere vorm) en wilt bijv. de C gaan binden met de A, DNA-polymerase maakt niet genoeg onderscheid hiertussen en bouwt hem in, echter vervalt het tautomeer en is de verkeerde nucleotide ingebouwd –> DNA-polymerase kan niet meer verder en dan is er 3’-5’ exonuclease activiteit (verkeerde base uit de streng knippen) –> DNA-polymerase kan weer doorgaan (nauwkeurigheid 1 op 1000)
- Mismatch reparatie: MSH2, MLH1, MSH6 en PMS2 vinden de mismatch en trekken EXO1 aan, deze ‘eet’ de foute nucleotide en een paar eromheen op en het gat wordt weer gevuld door DNA-polymerase
Hoe kun je een mismatch reparatie defect aantonen?
- Immunohistochemische kleuring: gebruik maken van antilichamen en kijken of eiwitten van het reparatie systeem aanwezig zijn
- Microsatellite instability assay (MSI): om wel aanwezige maar fout functionerende eiwitten te vinden, screening of het mismatch mechanisme werkt op gebieden in genomen (macrosatillite) die (mono-, di-, tri-) nucleotide repeats bevatten –> je krijgt bij replicatie erna of extra inbouw of deletie en dus wijzigt het aantal repeats
Wat is het Lynch syndroom (HNPCC)?
- mismatch reparatiemechanisme werkt niet goed –> hogere proliferatieve activiteit van darmepitheel –> hoger foutenpercentage –> ontstaan poliepen
- 5% veroorzaker van CRC, lifetime risico op CRC 70% en op endometrium carcinoom 55%
- surveillance vanaf 25 jaar 2x per jaar een colonoscopie van de gehele dikke darm, ook jaarlijks endometrium screenen
- bij het vinden direct het hele colon eruit halen (kan evt. ook preventief), >60 jaar, dan partiële colectomie (overlevingswinst bij een totale is gering)
Wat is synthetische letaliteit?
Het uitschakelen van een reparatie pathway die in tumorcellen en normale cellen zit, dit was voor tumorcellen de enige manier, dus zij overleven dit niet, normale cellen wel omdat zij nog een andere pathway hebben
- BER remmen d.m.v. PARP1-remmer, hierdoor uitschakeling tumorcellen, normale cellen kunnen overleven door HR (situatie bij BRCA mutatie) –> evt. i.c.m. hyperthermie, onder verwarming werkt het effectiever
Kanker:
- ontstaan klachten
- soort klachten
- epidemiologie
- risicofactoren ?
- ontstaan klachten: gemiddeld na 5 jaar (75% tussen gezond-dood), pas bij tumor >1 gram
- soort klachten: vermoeidheid, gewichtsverlies, koorts, algehele malaise, zwelling, rectaal bloedverlies, wisselend defecatiepatroon, lymfeklierzwelling, botpijn
- epidemiologie: 1 op de 3 mensen in NL, 105.000 per jaar
- risicofactoren: leeftijd, familiair, roken, alcohol, beroep, obesitas, zout, bewerkt vlees, weinig groente/fruit, straling, infecties, borstvoeding, postmenopauzale hormonen
Hoe werkt Next Generation Sequencing (NGS)?
Eerst PCR:
1. dubbelstrengs DNA-molecuul uit elkaar door temperatuurverhoging (>90 graden Celsius)
2. temperatuur omlaag –> complementaire primers (aan stukje template-DNA) toevoegen
3. basen worden toegevoegd
4. DNA-polymerase wordt toegevoegd
5. nieuwe DNA strengen worden gemaakt
Daarna 2 manieren:
- Targeted NGS (amplicon enrichment): specifiek deel van het genoom sequencen, label aan de PCR-primer en hierdoor dezelfde gebieden van verschillende individuen bekijken –> efficiënt, maar 1 fragment uit een bepaald gebied wordt gesequenced
- Hybridization enrichment: DNA in kleine fragmenten splitsen voordat het geamplificeerd wordt, hierna adapters voor latere sequencing toevoegen, interessante gebieden eruit halen (captured) en sequencen –> minder efficiënt, wel meerdere fragmenten van een bepaald gebied
–> hierna: m.b.v. adapters moleculen binden aan een flowcell –> DNA-fragmenten vermeerderen –> clusters van dezelfde moleculen –> aflezen bouwsteenvolgorde tijdens de synthese
Wat betekenen de begrippen ‘coverage’ en ‘VAF’ bij NGS?
- Coverage (deep sequencing): hoeveelheid dat een base-positie (onafhankelijk) bepaald is, hoe hoger de coverga hoe meer gesequenced is en hoe nauwkeuriger het resultaat
- VAF (variant allel frequency): aantal malen dat een DNA-variant op een specifieke positie wordt gevonden t.o.v. het referentie DNA (afhankelijk van gen en van tumor percentage)
Wat zijn de eigenschappen van NGS en waarvoor is het nuttig?
Single molecuul, duizenden fragmenten/analyse, output van 1-20 * 10^9 basen, weinig DNA nodig (20 ng), hoge gevoeligheid (1-2%), poolen van samples (barcode), bio-informatica nodig
Nuttig voor: bepalen diagnose, kiezen therapie, vinden erfelijke tumorsyndromen, onderscheid tussen weefsel van patiënten en kijken of het een primaire tumor of metastase is
Wat is het fusie-gen BCR-ABL en welk geneesmiddel helpt er tegen?
9;22 translocatie, breuk bij introns bij genen BCR (22) en ABL (9) –> ontstaan Philadelphia chromosoom (22) (nieuw fusie-gen)
– na het weghalen van de intronen ontstaat fusie-mRNA en hierna wordt een nieuw fusie-eiwit (p210^BCR-ABL) gevormd
– het gevormde eiwit is een enzym dat ATP kan binden en actief substraten gaat fosforyleren
- geneesmiddel Imatinib (Gleevec): tyrosine kinase inhibitor –> bindt op de plek (pocket) waar ATP in het BCR-ABL eiwit moet binden en inactiveert zo BCR-ABL –> bij mutatie pocket (in Abl1 gedeelte) kan imatinib niet meer binden –> daarom bij resistentie dasatinib, nilotinib, bosutinib of ponatinib geven of een stamceltransplantatie
Hoe is de celcyclus opgedeeld met fases, cyclines, cycline gekoppelde kinase (-remmers)?
G1: celgroei
- Cycline D: tijdens G1-fase actief, zorgt voor activatie van celcyclus na G1 (na groeisignaal) + CDK4 + CKI p16ink4a
- Cycline E: overgang van G1- naar S-fase en voortgang S-fase + CDK2 + CKI p21
S: verdubbeling DNA
- Cycline A: tijdens S-fase actief, zorgt voor progressie S-fase + CDK2 + CKI p21
G2: klaarmaken voor mitose
- Cycline B: tijdens G2-fase actief, zorgt voor overgang naar M-fase
M: mitose
- Profase: oprollen van het DNA om de histonen (condenseren) tot chromosomen
- Prometafase: celenvelop wordt afgebroken zodat chromosomen los komen te liggen in het cytoplasma
- Metafase: chromosomen komen in de metafaseplaat te liggen in het midden van de cel
- Anafase: chromosomen worden uiteen getrokken naar 2 tegenovergestelde polen
- Telofase: DNA wordt ontwonden en raakt weer open voor activiteit, kern wordt gevormd om de chromosomen
- Cytokinese: cel snoert in naar 2 afzonderlijke dochtercellen met beide een kern met chromosomen
Wat zijn de celcyclus checkpoints en hoe werken ze?
- Restrictie-punt: besluit van wel of niet delen/specialiseren (RB); groeifactor bind aan signaaltransductieroute –> activatie cycline D en binding aan CDK4 –> fosforylatie E2F en loskomen van RB-eiwit –> aanzetten cycline E en p16-eiwit
- G1/S-checkpoint: kijken of DNA beschadigd is (P53); bij beschadigd DNA p53 eiwit omhoog –> p21 (CKI) afschrijven –> cycline E/CDK2-complex remmen –> G1/S-arrest
- Intra S-fase-checkpoint: kijken of DNA beschadigd is (ATM); bij beschadigd DNA ATM activatie –> activatie CHK2 –> inactivatie cycline A/CDK2-complex –> remmen synthese, werking checken met radioresistente DNA-synthese (RDS)
- G2/M-checkpoint: kijken of DNA beschadigd is en of het volledig gerepliceerd is
- Anafase-checkpoint: kijken of de chromosomen goed gerangschikt zijn (BUB1): kijken of er spanning op microtubuli aan kinetochoor in metafase zit (MAD1/BUB1) –> bij een fout proces stoppen, soms Nijmegen breuk syndroom (Nbs1 en RAD50 –> dubbelstrengs DNA-breuken)
Welke technieken zijn er om chromosomen te kunnen zien en fouten hierin?
- Klassieke cytogenetica: chromosomen aankleuren (bijv. R Bandering)
- In situ hybridisatie (FISH) (kijken naar een specifiek gen)
- Chromosoom specifieke probes (FISH) (kijken naar een specifiek chromosoom)
- Karyogram: 45, XY, -7[10] (chromosoom 7 mist in 10 metafasen bij een mannelijk karyotype)
- SNP array
- Analyse van (CA)n repeats: in veel chromosomen vindt je CA repeats (veel = lange band in PCR, weinig = korte band), 2 allelen dragen verschillende hoeveelheden repeats (1 van vader, 1 van moeder), als er maar 1 band te zien nis dan ontbreekt er 1 allel en dus 1 chromosoom
- Moleculaire diagnostiek: RQ-PCR, Q-PCR, Sanger, Next generation sequencing (NGS); verlies van single nucleotide polymorphisms, basenparen normale plaats cellen vergelijken met tumorcellen
Hoe ontstaan de volgende afwijkingen
- dicentrisch chromosoom
- numerieke afwijking
- deletie ?
- dicentrisch chromosoom: Tijdens de metafase worden de chromosomen uit elkaar getrokken –> tubuli (kinetochoor) aan de verkeerde kant vastgemaakt –> hierdoor trek je van 2 verschillende kanten aan het chromosoom en krijg je een 4endeling waarna het chromosoom vaak breekt (vaak na bestraling, na een aantal keer deleties/translocaties –> verdwijnen dicentrisch chromosoom maar DNA-schade over
- numerieke afwijking: Tijdens de metafase van de mitose: alle chromosomen moeten aan 2 centromeren worden gemaakt en pas dan kan de anafase beginnen (tijdens metafase zendt kinetochoor signaal uit als niet alles vastzit) –> als een chromosoom niet vast zit voor de verdeling begint kan er een teveel of te weinig in komen (non-disjunctie) –> er zitten dan 3 in de ene cel en 1 in de andere cel
- deletie: Eerst een dubbelstrengs breuk in het DNA, hierna gaat het de mitose in; chromosomen worden netjes uitverdeeld alleen het deel aan de centromeer wordt netjes uitgelijnd terwijl het andere stukje niet verdeeld wordt (komt ergens middenin de cel terecht) –> na de mitose zal dit stukje in het cytoplasma van 1 van de dochtercellen circuleren en daar zal een micronucleoli (microkern) omheen gevormd worden –> meestal gaat het stukje hierna helemaal verloren
Hoe verloopt het proces van genamplificatie en wat zijn de gevolgen?
Soms wordt het chromosoom in de S-fase vaker verdubbeld waardoor meerdere kopieën van een gen ontstaan (genamplificatie), dit kan als een origin of replication niet stopt –> dit is zichtbaar als homogeen gekleurde gebieden in chromosomen
–> soms kan het uit het chromosoom springen en krijg je ‘double minute’ chromosomen wat mogelijk een groeivoordeel van de tumor kan opleveren
Wat is de functie van telomeren?
Uiteinde van DNA (dubbelstrengs breuk) en zorgen voor bescherming
– bij een fout; einde wordt herkend als een breuk –> ontstaan dicentrische chromosomen (bij reparatie door NHEJ) waardoor er genomische instabilieit komt –> dit wordt voorkomen door de T-loop en eiwitten waardoor het niet herkenbaar is
- beperken van celgroei: na elke deling verkorten de telomeren (in stamcellen m.b.v. telomerase wel in stand gehouden) en als ze te kort dreigen te worden geven ze een signaal af (M1 Hayflick Limit), als ze hierna nog een paar keer delen zijn de telomeren echt te kort (M2-crisis) en ontstaat chromosomale instabiliteit met celdood als gevolg
- tumorcellen hebben alternatieve telomeerverleging door telomerase tot expressie te brengen (85-90%) of via het ALT-mechanisme
Hoe vindt het kweken van cellen voor cytogenetisch onderzoek plaats?
- Beenmerg en bloed als kweekmedium en hieraan groeifactoren toevoegen om leukemische cellen te triggeren om te delen (1-2 dagen)
- Met een colcemid de celdeling stopzetten (mitose blok) en dus chromosomen tijdens de metafase bevriezen (half uur)
- Hypotone oplossing toevoegen waardoor cellen zwellen en kapot gaan
- Kapotte cellen (met celkern en celdeling) fixeren met methanol-azijnzuur waardoor het membraan ontvet wordt
- Suspensie op het glaasje druppelen waardoor membranen breken
- Kleuring en bandering (R-, G- of Q-bandering) waarna er een (unieke) streepjescode op elk chromosoom te zien is
Wat is FISH (fluorescence in situ hybridization) en wat zijn de voor- en nadelen?
Methode om mutaties zichtbaar te maken: onderzoek gericht op een specifieke target (bijv. plek x op chromosoom x) en hierdoor beperkt
1. DNA wordt gesmolten door te verwarmen waardoor de strengen uit elkaar gaan
2. Een stukje enkelstrengs DNA (probe) wordt eroverheen gewassen wat hecht aan het uiteengesmolten DNA
3. Probe wordt gebruikt om aan te tonen of het stukje DNA wel/niet aanwezig is in de patiënt
4. Een fluorescerend label wordt aan de probe geplakt zodat hij terug te vinden is
–> kan bij gekweekte/delende cellen (metafase FISH) en niet/slecht delende cellen (interfase FISH)
Soorten probes:
- Fusion probes: voor translocaties aan te tonen, fusiesignaal is geel (rood+groen), wel een probleem als rood boven groen ligt (3D-structuur) want dan krijg je onterecht geel
- Break-apart probes: als er een breuk tussen 2 stukken komt, bij geen translocatie dan 2 fusies (2x geel), bij een translocatie is er 1 fusie en ook 1 groen-rood signaal
Voordelen: detectie microdeleties, breukpunt detectie en verbetering, detectie van cryptische translocaties en complexe genoom veranderingen, snelle diagnostische detectie op kernen in interfase, kleine hoeveelheid afwijkende cellen zichtbaar
Nadelen: gelimiteerde sensitiviteit, beperkte target locaties, alleen antwoord op welke vragen je stelt
Waarom is er bij een multiple myeloom (MM) een probleem bij chromosoomonderzoek en wat is de oplossing hiervoor?
Afwijkende cellen komen niet in deling, dus klassieke technieken leveren een normaal karyotype op en een aantal afwijkingen zijn chromosomaal niet zichtbaar (cryptisch)
Oplossing: hoger % plasmacellen nodig dus zuivering van plasmacellen
1. rode bloedcellen verwijderen uit beenmerg door rode bloedcel lysis
2. antilichamen maken tegen CD-138 (buitenkant plasmacellen) waaraan beads (magneten) worden gekoppeld
3. CD-138 met het antilichaam laten binden en er een magneet bij houden waardoor de beads samen met de plasmacellen hangen aan de magneet en ze alleen overblijven
Wat is de SNP-array (single nucleotide polymorphism)?
Genoom-breed kijken en fouten met kleine resoluties in kaart brengen
- Onderzoek met 850.000 probes
- Testen of iemand voor een bepaalde SNP homozygoot of heterozygoot is
- Analyse m.b.v. LogR (maat voor aantal kopieën) en B-allele frequency (frequentie van de SNP)
1 allel zichtbaar = depletie, 3 allelen = duplicatie, 2 allelen maar alleen AA en BB zichtbaar (niet AB) = verlies heterozygositeit
In de praktijk: geen 100% zuivere populatie, dus ook normale cellen erdoor die interfereren
Hoe werkt de circadiane klok?
- omlooptijd van 25 uur
- werkt door licht-resetting door neuronen van de suprachiasmatische nucleus (SCN)
- Cry-genen worden vanaf e-box promotor afgeschreven; negatieve loop (core loop): cryptochroom eiwitten gaan terug naar de kern, zorgen voor cyclische remming door remmen van transcriptiefactoren Clock en Bmal1 via de vorming van een CRY/PER complex. Positieve loop (stabiliserende loop): Bmal1 activatie via Rev-Erba
- stabiliteit (timing beïnvloeden) door posttranslationele modificatie van PER- en CRY-eiwitten
- chronotype; snellere klok (ochtendmens) of langzamere (avondmens)
- koppeling klok met gedrag en metabole processen verloopt via klok-gecontroleerde genen (CCG’s) die ritmisch tot expressie komen
- per orgaan 10-20% van actieve genen o.i.v. circadiane klok (temporele organisatie) hierdoor verschillende piekmomenten op de dag
Wat zijn acute en chronische klachten bij een circadiane desynchronie?
Als er een verschil in lichaamstijd en geografische tijd is
- Acuut: slaaptekort, vermoeidheid, minder alert, lager prestatievermogen
- Chronisch: metabole verstoringen (hoger risico op diabetes, HVZ en obesitas), versnelde tumorinductie en veranderd tumorspectrum (risicofactor voor borstkanker)
Hoe is de celcyclus gekoppeld aan de circadiane klok en wat betekend dit voor kankercellen en medicatie?
Cellen delen altijd op hetzelfde moment op de dag (niet alle cellen allemaal, maar elke cel heeft zijn eigen moment), meestal 20 uur tussen de 2 celdelingen
Deling van tumorcellen loopt asynchroon met de celcyclus omdat ze op ieder moment van de dag kunnen delen
Medicatie: chronotherapeutica met chronotoxiciteit (toxisch effect afhankelijk van tijdstip van blootstelling) wil je ook op bepaalde momenten op de dag (niet) geven, zodat je gezonde cellen die delen niet beschadigd –> kijken of er circadiane variatie zit in symptomen, gevoeligheid voor geneesmiddel van orgaan en farmacokinetiek afhankelijk van tijdstip van toediening
