Geneeskunde 2A1 HC week 3 - 15/9 Flashcards
Waarom doe je genetisch onderzoek bij hematologische maligniteiten?
- Relevant voor de diagnose: sommige mutaties zijn bijv. altijd CML/AML ook al presenteert het zich anders
- Belangrijk voor bepaling van prognose: bepaalde mutaties hebben standaard een goede/slechte prognose
- Gerelateerd aan de reactie op chemotherapie
- Identificatie van betrokken genen: vertelt wat over de leukemogenesis en hematopoëse
–> bij 50% v.d. patiënten met AML geen afwijkingen in chromosomen, alleen moleculaire afwijkingen (11% complex karyotype, 23% zowel chromosomaal als genetische afwijkingen)
Waarmee vindt detectie en identificatie van chromosomale afwijkingen plaats?
- Klassieke cytogenetica: banderingstechnieken
- Moleculaire cytogenetica: fluorescente in situ hybridisatie (FISH) en Array (SNP array)
- Moleculaire diagnostiek: RQ-PCR (fusiegenen), Q-PCR en Sequencing (Sanger of NGS)
Hoe vindt het kweken van cellen voor cytogenetisch onderzoek plaats?
- Beenmerg en bloed als kweekmedium en hieraan groeifactoren toevoegen om leukemische cellen te triggeren om te delen (1-2 dagen)
- Met een colcemid de celdeling stopzetten (mitose blok) en dus chromosomen tijdens de metafase bevriezen (half uur)
- Hypotone oplossing toevoegen waardoor cellen zwellen en kapot gaan
- Kapotte cellen (met celkern en celdeling) fixeren met methanol-azijnzuur waardoor het membraan ontvet wordt
- Suspensie op het glaasje druppelen waardoor membranen breken
- Kleuring en bandering (R-, G- of Q-bandering) waarna er een (unieke) streepjescode op elk chromosoom te zien is
Welke typen chromosomale afwijkingen zijn er?
Numerieke afwijkingen:
- Winst (compleet chromosoom)
- Verlies (compleet chromosoom)
Structurele afwijkingen:
Gebalanceerd: delen uitgewisseld, maar nette niets verloren
- Translocatie: 2 stukken chromosomaal materiaal uitwisselen
- Inversie: stuk chromosoom is 180 graden gedraaid (aan P- (korte) of Q-arm (lange) = paracentrisch, of rondom centromeer = pericentrisch)
- Insertie: interstitieel stukje verplaatst
Niet-gebalanceerd:
- Deletie: deel chromosoom verloren, terminaal (einde) of interstitieel (midden)
- Amplificatie: duplicatie
- Niet-gebalanceerde translocatie
- Gen mutatie: basenpaarniveau
Wat zijn belangrijke kenmerken van het chromosoom?
- P-arm: korte arm, hebben chromosoom 13,14,15,20&21 niet zij hebben een repititieve DNA-sequentie voor ribosomaal DNA (bij een translocatie gaat dit verloren, maar geen gevolg omdat dit vaker aanwezig is)
- Q-arm: lange arm
- Centromeer: insnoering
- Banden: geven gebieden op het chromosoom weer, zijn genummerd
Hoe wordt een beschrijving van het karyogram weergegeven?
Eerst chromosomenaantal, dan geslacht en dan bijzonderheden: bijv. 45, XY, -7[10]
–> chromosoom 7 mist in 10 metafasen bij een mannelijk karyotype
Breekpunten worden als volgt aangegeven; t(9;11)(p22;q23)
–> translocatie van chromosomen 9 en 11, op chromosoom 9 zit het breukpunt op P-arm op plek 22 en bij chromosoom 11 op Q-arm op plek 23
Wat zijn AML slecht en goed risico afwijkingen?
Slecht risico: complex karyotype, monosomaal karyotype (2 autosomale monosomieën (verlies) of 1 verlies en 1 structurele afwijking) (zeer slechte overall survival van 7% ondanks allogene stamceltransplantatie)
Goed risico: (t8;21), inv(16)
Zie ook de afbeelding!
Wat is FISH (fluorescence in situ hybridization) en wat zijn de voor- en nadelen?
Methode om mutaties zichtbaar te maken: onderzoek gericht op een specifieke target (bijv. plek x op chromosoom x) en hierdoor beperkt
1. DNA wordt gesmolten door te verwarmen waardoor de strengen uit elkaar gaan
2. Een stukje enkelstrengs DNA (probe) wordt eroverheen gewassen wat hecht aan het uiteengesmolten DNA
3. Probe wordt gebruikt om aan te tonen of het stukje DNA wel/niet aanwezig is in de patiënt
4. Een fluorescerend label wordt aan de probe geplakt zodat hij terug te vinden is
–> kan bij gekweekte/delende cellen (metafase FISH) en niet/slecht delende cellen (interfase FISH)
Voordelen: detectie microdeleties, breukpunt detectie en verbetering, detectie van cryptische translocaties en complexe genoom veranderingen, snelle diagnostische detectie op kernen in interfase, kleine hoeveelheid afwijkende cellen zichtbaar
Nadelen: gelimiteerde sensitiviteit, beperkte target locaties, alleen antwoord op welke vragen je stelt
Welke verschillende FISH probe designs worden gebruikt?
- Fusion probes: voor translocaties aan te tonen, fusiesignaal is geel (rood+groen), wel een probleem als rood boven groen ligt (3D-structuur) want dan krijg je onterecht geel
- Break-apart probes: als er een breuk tussen 2 stukken komt, bij geen translocatie dan 2 fusies (2x geel), bij een translocatie is er 1 fusie en ook 1 groen-rood signaal
Waarom is er bij een multiple myeloom (MM) een probleem bij chromosoomonderzoek en wat is de oplossing hiervoor?
Afwijkende cellen komen niet in deling, dus klassieke technieken leveren een normaal karyotype op en een aantal afwijkingen zijn chromosomaal niet zichtbaar (cryptisch)
Oplossing: hoger % plasmacellen nodig dus zuivering van plasmacellen
1. rode bloedcellen verwijderen uit beenmerg door rode bloedcel lysis
2. antilichamen maken tegen CD-138 (buitenkant plasmacellen) waaraan beads (magneten) worden gekoppeld
3. CD-138 met het antilichaam laten binden en er een magneet bij houden waardoor de beads samen met de plasmacellen hangen aan de magneet en ze alleen overblijven
Wat is de SNP-array (single nucleotide polymorphism)?
Genoom-breed kijken en fouten met kleine resoluties in kaart brengen
- Onderzoek met 850.000 probes
- Testen of iemand voor een bepaalde SNP homozygoot of heterozygoot is
- Analyse m.b.v. LogR (maat voor aantal kopieën) en B-allele frequency (frequentie van de SNP)
1 allel zichtbaar = depletie, 3 allelen = duplicatie, 2 allelen maar alleen AA en BB zichtbaar (niet AB) = verlies heterozygositeit
In de praktijk: geen 100% zuivere populatie, dus ook normale cellen erdoor die interfereren
Wat zijn de verschillen in detectiemogelijkheden tussen FISH en SNP-array
Bij beide zichtbaar: winst van een heel chromosoom, deleties, gains
Bij FISH: translocaties zichtbaar
Bij SNP-array: verlies van heterozygositeit zichtbaar
Uit welke 4 fasen bestaat de celcyclus?
- G1-fase: celgroei en beslissen en restrictiepunt: kiezen om te delen of niet
- S-fase: duplicatie van chromosomen
- G2-fase: voorbereiding op de celdeling
- M-fase: celdeling naar 2 dochtercellen
Wat zijn de 3 belangrijkste klassen genen van de celcylus?
- Cyclines
- Cycline afhankelijke kinases (CDKs)
- Cycline afhankelijke kinase remmers (CKIs)
Welke cyclines zijn er en wat is hen functie?
- Cycline D: tijdens G1-fase actief, zorgt voor activatie van celcyclus na G1 (na groeisignaal)
- Cycline E: overgang van G1- naar S-fase en voortgang S-fase
- Cycline A: tijdens S-fase actief, zorgt voor progressie S-fase
- Cycline B: tijdens G2-fase actief, zorgt voor overgang naar M-fase
Wat zijn de cycline afhankelijke kinase (CDKs) en -remmers (CKIs)?
Cycline afhankelijke kinase (CDK): zijn continu aanwezig en zijn alleen actief als ze met cycline binden
- fosforyleren eiwitten die nodig zijn voor celcyclus progressie
- CDK4 bindt aan cycline D en CDK2 bindt aan cycline E en A
Cycline afhankelijke kinase remmers (CKI): binden aan Cyc/CDK-complexen en remmen de kinase activiteit
- Met name actief in de G1-fase (na signalen van buiten de cel of na DNA-schade)
- CKI p16ink4a remt cycline D (met CDK4) en CKI p21 remt cycline A en E (met CDK2)
Wat zijn celcyclus checkpoints?
DNA mag alleen gerepliceerd worden als er geen beschadigingen zijn, rondom de checkpoints wordt gecontroleerd op beschadigingen/afwijkingen:
- Restrictie-punt: besluit van wel of niet delen/specialiseren (RB)
- G1/S-checkpoint: kijken of DNA beschadigd is (P53)
- Intra S-fase-checkpoint: kijken of DNA beschadigd is (ATM)
- G2/M-checkpoint: kijken of DNA beschadigd is en of het volledig gerepliceerd is
- Anafase-checkpoint: kijken of de chromosomen goed gerangschikt zijn (BUB1)
Hoe werkt de signaaltransductie voor celdeling van een cel?
- Groeifactoren binden aan een groeifactor-receptor op het celmembraan
- Signaaltransductieroute in gang gezet –> signaal doorgeven van cytoplasma naar kern
- Activatie cycline D
- Binding van cycline D aan CDK4 zorgt voor een actief complex –> fosforylatie van eiwitten waaronder E2F waardoor het loskomt van het gefosforyleerde RB-eiwit
- E2F is een transcriptiefactor die cycline E voor de S-fase aanzet en p16-eiwit activeert waardoor cycline D activiteit geremd wordt (terugkoppeling)
Hoe werkt het G1/S checkpoint?
Als DNA beschadigd raakt in een normale cel gaat het p53 eiwit omhoog (tumor suppressor eiwit) –> hierdoor wordt p21 (CKI) afgeschreven en wordt het cycline E/CDK2-complex geremt –> geen overgang van G1- naar S-fase (G1/S-arrest)
In een mutant p53 cel gaat het niveau niet omhoog en zal er geen G1/S-arrest plaatsvinden en gaat het beschadigde DNA naar de S-fase om gerepliceerd te worden –> replicatie van beschadigd DNA wat kan worden omgezet naar mutaties –> risicofactor voor kanker
Hoe werkt het intra S-checkpoint?
In een normale cel wordt bij DNA-beschadiging het ATM (tumor suppressor gen) geactiveerd –> ATM activeert CHK2 wat cycline A/CDK2-complex inactiveert –> synthese van DNA in S-fase geremd
In een mutante ATM cel zal cycline A/CDK2-complex niet worden geremd –> replica beschadigd DNA –> omgezet naar mutaties en risicofactor voor kanker
- Bij een geboren ATM-defect de ziekte van ataxia telangiectasia (AT): overgevoeligheid voor röntgenstraling en kankerpredispositie
- Defect intra S-checkpoint kan worden gemeten via radioresistente DNA-synthese (RDS), na röntgenbestraling voeg je een radioactieve bouwsteen van DNA (3H-Thymidine) toe die ondanks DNA-schade wordt ingebouwd, in de controle cel zal DNA-synthese wel geremd worden een geen inbouw van 3H-Thymidine
Hoe werkt het anafase checkpoint?
Vindt eigenlijk plaats tijdens de metafase!
Tijdens mitose binden microtubuli aan het kinetochoor en centrosoom (vorming mitotische spindle) –> centrosomen trekken chromosomen uit elkaar en in kinetochoor zitten spanningsgevoelige eiwitten (MAD1, BUB1) die decteren of microtubuli gebonden zijn en op spanning staan –> bij een fout wordt het proces gestopt
Als het anafase checkpoint defect is wordt het chromosoom (2 zusterchromatiden) naar 1 dochtercel getrokken en ontstaat aneuploïdie: extra chromosoom in een dochtercel
Wat doen de Nbs1 en RAD50 genen?
Binden aan dubbelstrengs DNA-breuken om strengen bij elkaar te houden –> voor het herkennen is ATM-kinase nodig (verhoogde CHK2 activiteit –> inactivatie cycline A/CDK2-complex –> DNA-synthese remmen)
In afwezigheid van Nbs1/RAD50 wordt DNA-synthese niet geremd en ontstaat een RDS-fenotype in AT-cellen (geen ATM-kinase aanwezig) –> hierdoor ontstaat verkeerd herstel van dubbelstrengs breuken wat leidt tot translocaties en genomische instabiliteit
Hoe werkt de circadiane klok?
Raderwerk van klokgenen en klokeiwitten die elkaar periodiek aan- en uitschakelen
Cry-genen worden vanaf e-box promotor afgeschreven
- negatieve loop (core loop): cryptochroom eiwitten gaan terug naar de kern, zorgen voor cyclische remming door remmen van transcriptiefactoren Clock en Bmal1 via de vorming van een CRY/PER complex
- positieve loop (stabiliserende loop): Bmal1 activatie via Rev-Erba
Dit proces zit in iedere perifere cel (licht onafhankelijk) en worden iedere dag gelijk gezet door stimuli uit de SCN (bijv. hormonen of neutrale stimuli) (cellen die wel licht afhankelijk zijn)
Zie ook de afbeelding!
Wat is het chronotype van de circadiane klok?
Ieder heeft zijn eigen chronotype wat aangeeft of je meer een ochtend- of avondmens bent
- Ochtend mensen: snellere klok
- Avond mensen: langzamere klok
–> koppeling klok met gedrag en metabole processen verloopt via klok-gecontroleerde genen (CCG’s) die ritmisch tot expressie komen
Wat is de invloed van de circadiane klok op de genen?
Per orgaan 10-20% van alle actieve genen o.i.v. circadiane klok –> temporele organisatie aan het lichaam
Verschillende genen hebben een verschillende piekactiviteit op verschillende momenten van de dag (zie afbeelding!)
Het stelt ook de lichaamsfuncties in staat om te anticiperen op verschillende behoeften op bepaalde momenten van de dag, hij is ook evolutionair geconserveerd
Wat is de relatie tussen tumorcellen en de circadiane klok?
Veel chemotherapeutica werken op delende cellen alleen de deling van tumorcellen loopt asynchroon met de celcyclus omdat ze op ieder moment van de dag kunnen delen
–> chronotherapeutica werken het best als ze door het hele lichaam worden getolereerd daarom moet eerst worden gekeken hoe de interne klok van de patiënt in elkaar zit (chronotype) daarna kunnen chemo’s hierop afgesteld worden dat ze zo min mogelijk gezonde cellen beschadigen
