GEN2: Laboration om p53 och cellskada Flashcards
Vad är mutationsanalys och hur går den till?
Denna metod bygger på två saker: 1) sangersekvensering och 2) analys jämför med Humana genomet.
En Sangersekvensering betyder att man suntetiserar nya DNA-strängar ifrån ssDNA och via slumpen sätter in konstgjorda A, C, G och T. Detta är flourescentyl labeled base-specific DNA – vilket gör att DNA kedjan slutar. Detta gör att vi får massa olika länger på DNA gör att man kan läsa ut ordningen på baserna (få ut DNA kod).
Denna DNA kod (som är för p53) jämför/analyseras sedan med humana genomet där man letar efter skillnader i baspar. Skillnader tyder på mutation.
vad är western blot? och hur används det för parp1 och p21?
Western blot används för att mäta relativa mängder av specifika proteiner från en mix av alla proteiner i en cellinje: så kallade cell lysate. Man kan mäta storlek på proteiner.
Metod
Mixen med proteiner sätts i en Polyacrylamide Gel elecrophoresis (PAGE): proteinerna får vandra genom ett matrix (nätstruktur), där större och tyngre molekyler kommer att få det svårare att vandra nedåt medan mindre lättare proteiner vandrar nedåt snabbare och hamnar längre ned. Laddning, massa och form påverkar migration genom nätstrukturen.
Allting på den känsliga gelen flyttas över till ett starkare membran som är lättare att hantera. Membranet läggs i en washing solution och sedan i mjölk som har antikroppar som binder till allting förutom proteinerna som redan finns på membranet. Sedan tillförs en primär antikropp som binder till proteinerna (p21 samt parp i vardera laborationen) och därefter tillförs en sekundär antikropp. Den sekundära antikroppen binder till den primära och kommer att färgas in, detta hjälper oss att markera de specifika proteinerna p21 och parp-1 och deras mängd.
vad är parp 1?
Parp-1 är ett protein som uttrycks vid DNA skador och är ett viktigt protein som attraherar andra proteiner för reparation av DNA skadan. När cellen utför apoptos så sätts en kaskad igång som aktiverar kaspas 3 som klyver parp-1 vilket gör att det 116 kDa långa proteinet klyvs till 89 kDA fragment, clip-parp. Klyvningen är då ett tecken på att behandlingen fungerar som den ska. P53 är kopplad till parp-1, mutationer på tP53 ger ökad resistens för parp-1 medierad celldöd.
vad är cellcykelanalys?
Metod
- Varje prov centrifugeras för skilja ut cellerna
- Till varje prov så tillsätts en trypsin-lösning (lösning A) vilken är nedbrytande
- Efteråt tillsätts lösning B, vilket är en trypsin-hämmare
- Sist tillsätts lösning C, vilket består av Propidium iodide vilket färgar in DNA
- Alla prover analyseras med Flödescytometri vilket ger den procentuell andel celler i G0-G1, S och G2-M fasen
vad är fetonreaktion?
Övergångsmetaller och koppar kan avge eller ta emot fria elektroner under intracellulära reaktioner, och kan på så vis förstärka bildandet av ROS.
Exemepel är Järn, där den donerar en elektron (från Fe2+ till Fe3+), reagerar den med väteperoxid och bildar hydroxylradikalen.
vad är järnkelare?
I laboration tillsatte vi fritt järn för att undersöka reaktionens verkningar Därefter tillsatte vi också järnkelerare, vilket är ett ämne som binder järn, för att se om det blev någon skillnad i oxidativ stress I vården används järnkelerare vid järnförgiftning.
LAMP-2 är en möjlig biomarkör då den visar uniform ökning mellan de sjuka och friska grupperna. Cathepsin B visar ingen skillnad medan cathepsin L visar individuella variaConer inom båda grupperna och dessa är därför inte lämpliga markörer.
