Aula 9 - Sequenciacao Flashcards
Mutação já identificada
RFLP
Mutação não identificada
Métodos físicos
Mismatch cleavage methods
Outros
Métodos físicos
Tiram partido da mobilidade diferente em eletroforese
Mutações não identificadas
SSCP
HA
DGGE
Outros
PPT
DNA microarrays
dHPLC
Sequenciacao
RFLP (restriction fragment length polymorphism)
Mutação já identificada
Atividade diferencial de enzimas de restrição
Paramiloidose/ doença dos pezinhos
Fibrose cística
Paramiloidose/doença dos pezinhos
PCR
Enzima de restrição NsiI corta onde tem mutação
Indivíduo normal: uma banda - 2 alelos normais com base guanina
Indivíduo heterozigotico: 3 bandas- um alelo normal com guanina, e um alelo digerido com adenina
Fibrose cística
Patologia recessiva
Gene muito grande
Não se sabe a priori em que exao se encontra a alteração
SSCP (single stranded conformation polymorphism)
PCR
Desnaturação (fica cadeia simples)
Arrefecimento
Eletroforese em poliacrilmida não desnaturante
Indivíduo normal: 2 bandas, com cadeias sense e anti-sense dos 2 alelos
Indivíduo mutante: 2 bandas do alelo normal e 2 do alelo mutado (4 bandas)
Aspetos importantes
Quantidade de G/C no fragmento condiciona estrutura
Localização no gene
Tamanho (até 150pb)
Desvantagens em SSCP
Sensibilidade decrescência aumento de tamanho de fragmento
Baixa deteção em G/C
Necessária sequenciacao
Heteroduplex analysis (HA)
PCR
Desnaturação
Renaturacao
Eletroforese em poliacrilmida não desnaturante
Fica:
Homoduplexes wild type ou homoduplexes mutados ou heteroduplexes
Zona de mismatch
Heteroduplexes migram menos que homoduplexes
Heteroduplex Analysis (HA) vantagens e desvantagens
Vantagens: sensível para inserções/deleções
Desvantagens: pouco sensível para mutações pontuais
Precisa de sequenciacao
DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis)
Vê melting point acho eu
PCR
Desnaturação
Mistura de wild type e mutados
Renaturacao
Obtém-se homoduplexes wild type e mutados e heteroduplexes
Eletroforese em gel de gradiente crescente de solução desnaturante
Homoduplexes e heteroduplexes desnaturam em pontos diferentes do gel de gradiente
Quanto mais homólogo mais difícil desnaturação, maior melting point
DGGE desvantagens
Pouco eficiente para fragmentos grandes
Métodos de sequenciacao
Sequenciacao manual
Sequenciacao automática
Sequenciacao de nova geração (NGS)
Sequenciacao manual
Método químico (Maxam Gilbert)
Método enzimático (sanger-coulson)
ddNTPs (dideoxinucleotideos)
Tem grupo -OH na posição 3C substituído por um H
Método enzimático (Sanger e Coulson)
Primer para amplificação
Mistura de PCR em 4 tubos
Em cada um usa-se ddNTP’s diferente (A, G, T ou C) marcados com isótopo radioativo
Termociclador
Ciclos (desnaturação, annealing, extensão)
Aleatoriamente são incorporadas bases normais ou ddNTPs (quando ddntps síntese para)
Eletroforese em gel
Sequenciacao automática
PCR prévio
Desenho do primer (só 1!)
….
Incorporação aleatória de nucleotideos normais ou ddntps
Ddntps tem cor específica
Formaida (DNA fica cadeia simples)
Eletroforese capilar
Eletrofluorograma (picos)
Sequenciacao automática desvantagens
Cara
Pouco eficiente para fragmentos grandes
Sequenciacao nova geração
Reduz custos
Sequência exoma inteiro em pouco tempo
Plataformas de 2 geração - amplificação clonal
Ancorarem de fragmentos a suporte físico
Sequenciacao em paralelo (alinhamento de reads)
Sequenciacao in situ
Multiplexing
Cada amostra tem seq sinalizadora específica (código de barras)
Fragmentação e sequenciacao
Diferenciação de reads e separação por código de barras
Alinhamento de reads
Plataforma da ilumina
Superfície sólida Nucleotideos reversíveis Software deteta cor Lavagem Leitura e lavagem sucessivas
Plataforma da Roche/ pirosequenciacao
DNA associado a grânulos
Adiciona nucleotides - liberta pirofosfato - liberta luz com ação da luciferase
Ppi libertado é utilizado por ATP sulfurilase para produzir ATP ( fonte de energia para luciferase)
Sequência de nova geração desvantagem
Dificuldade em ler homopolimeros
Dificuldade no armazenamento de informação
Erros de leituras
