Aula 9 - Sequenciacao

Question 1

Mutação já identificada

Answer 1

RFLP

Question 2

Mutação não identificada

Answer 2

Métodos físicos
Mismatch cleavage methods
Outros

Question 3

Métodos físicos

Answer 3

Tiram partido da mobilidade diferente em eletroforese
Mutações não identificadas

SSCP
HA
DGGE

Question 4

Outros

Answer 4

PPT
DNA microarrays
dHPLC
Sequenciacao

Question 5

RFLP (restriction fragment length polymorphism)

Answer 5

Mutação já identificada
Atividade diferencial de enzimas de restrição

Paramiloidose/ doença dos pezinhos
Fibrose cística

Question 6

Paramiloidose/doença dos pezinhos

Answer 6

PCR
Enzima de restrição NsiI corta onde tem mutação

Indivíduo normal: uma banda - 2 alelos normais com base guanina

Indivíduo heterozigotico: 3 bandas- um alelo normal com guanina, e um alelo digerido com adenina

Question 7

Fibrose cística

Answer 7

Patologia recessiva
Gene muito grande
Não se sabe a priori em que exao se encontra a alteração

Question 8

SSCP (single stranded conformation polymorphism)

Answer 8

PCR
Desnaturação (fica cadeia simples)
Arrefecimento
Eletroforese em poliacrilmida não desnaturante

Indivíduo normal: 2 bandas, com cadeias sense e anti-sense dos 2 alelos

Indivíduo mutante: 2 bandas do alelo normal e 2 do alelo mutado (4 bandas)

Aspetos importantes
Quantidade de G/C no fragmento condiciona estrutura
Localização no gene
Tamanho (até 150pb)

Question 9

Desvantagens em SSCP

Answer 9

Sensibilidade decrescência aumento de tamanho de fragmento
Baixa deteção em G/C
Necessária sequenciacao

Question 10

Heteroduplex analysis (HA)

Answer 10

PCR
Desnaturação
Renaturacao
Eletroforese em poliacrilmida não desnaturante

Fica:

Homoduplexes wild type ou homoduplexes mutados ou heteroduplexes

Zona de mismatch

Heteroduplexes migram menos que homoduplexes

Question 11

Heteroduplex Analysis (HA) vantagens e desvantagens

Answer 11

Vantagens: sensível para inserções/deleções

Desvantagens: pouco sensível para mutações pontuais
Precisa de sequenciacao

Question 12

DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis)

Answer 12

Vê melting point acho eu

PCR
Desnaturação
Mistura de wild type e mutados
Renaturacao
Obtém-se homoduplexes wild type e mutados e heteroduplexes
Eletroforese em gel de gradiente crescente de solução desnaturante
Homoduplexes e heteroduplexes desnaturam em pontos diferentes do gel de gradiente

Quanto mais homólogo mais difícil desnaturação, maior melting point

Question 13

DGGE desvantagens

Answer 13

Pouco eficiente para fragmentos grandes

Question 14

Métodos de sequenciacao

Answer 14

Sequenciacao manual
Sequenciacao automática
Sequenciacao de nova geração (NGS)

Question 15

Sequenciacao manual

Answer 15

Método químico (Maxam Gilbert)

Método enzimático (sanger-coulson)

Question 16

ddNTPs (dideoxinucleotideos)

Answer 16

Tem grupo -OH na posição 3C substituído por um H

Question 17

Método enzimático (Sanger e Coulson)

Answer 17

Primer para amplificação
Mistura de PCR em 4 tubos
Em cada um usa-se ddNTP’s diferente (A, G, T ou C) marcados com isótopo radioativo
Termociclador
Ciclos (desnaturação, annealing, extensão)
Aleatoriamente são incorporadas bases normais ou ddNTPs (quando ddntps síntese para)
Eletroforese em gel

Question 18

Sequenciacao automática

Answer 18

PCR prévio
Desenho do primer (só 1!)
….

Incorporação aleatória de nucleotideos normais ou ddntps
Ddntps tem cor específica

Formaida (DNA fica cadeia simples)
Eletroforese capilar
Eletrofluorograma (picos)

Question 19

Sequenciacao automática desvantagens

Answer 19

Cara

Pouco eficiente para fragmentos grandes

Question 20

Sequenciacao nova geração

Answer 20

Reduz custos
Sequência exoma inteiro em pouco tempo

Plataformas de 2 geração - amplificação clonal
Ancorarem de fragmentos a suporte físico
Sequenciacao em paralelo (alinhamento de reads)
Sequenciacao in situ

Question 21

Multiplexing

Answer 21

Cada amostra tem seq sinalizadora específica (código de barras)
Fragmentação e sequenciacao
Diferenciação de reads e separação por código de barras
Alinhamento de reads

Question 22

Plataforma da ilumina

Answer 22

Superfície sólida
Nucleotideos reversíveis 
Software deteta cor
Lavagem
Leitura e lavagem sucessivas

Question 23

Plataforma da Roche/ pirosequenciacao

Answer 23

DNA associado a grânulos
Adiciona nucleotides - liberta pirofosfato - liberta luz com ação da luciferase

Ppi libertado é utilizado por ATP sulfurilase para produzir ATP ( fonte de energia para luciferase)

Question 24

Sequência de nova geração desvantagem

Answer 24

Dificuldade em ler homopolimeros
Dificuldade no armazenamento de informação
Erros de leituras