Aula 8 - Técnicas De DNA Recombinante

Question 1

Técnica DNA recombinante passos

Answer 1

Síntese do cDNA 
Inserção de enzimas de restrição 
Ligação de cDNA ao vetor
Formação de plasmideo recombinante
Transformação bacteriana
Crescimento e multiplicação das bactérias com DNA recombinante
Purificação das proteínas 
Teste de eficácia em animais
Ensaio em humanos

Question 2

Síntese do cDNA

Answer 2

A partir de mRNA com primers e transcriptase reversa

Não se pode usar DNA pq bactérias não fazem splicing
(Não se coloca mRNA pq era degradado/ radioativo)

Question 3

Cadeias

Answer 3

Cadeia sense: 5’ para 3’, vai dar origem a proteína

Cadeia anti-sense: 3’ para 5’

Question 4

Enzimas de restrição

Answer 4

Endonucleases

Reconhecem sequências de 4-8 nucleotidos

Question 5

Sequências palindromicas

Answer 5

Com um eixo de simetria

Question 6

Extremidades

Answer 6

Blunt: sem núcleos desemparelhados (abruptas)

Sticky: com nucleotidos desemparelhados (coesivas)

Usam-se as coesivas para clivar vetor e o cDNA de interesse

Question 7

Ligação do cDNA ao vetor

Answer 7

T4 DNA ligase

Gasto de energia

Question 8

BAC’S e YAC’s

Answer 8

usados na sequenciacao de genomas

Question 9

Plasmideos

Answer 9

Vetores circulares de DNA
Extracromossomais
Cadeia dupla e autoreplicativa

Question 10

Marcador seletivo (ampR)

Answer 10

Seleciona apenas bactérias com o plasmideo

Ex: ampicilina

Question 11

Polylinker

Answer 11

Local rico em sequências de restrição

Local de inserção do DNA

Question 12

Vetores da expressão para sistemas Eucarioticas

Answer 12

Devem conter mais informação

Question 13

Transformação bacteriana

Answer 13

Inserção de plasmideo recombinante na bactéria

Método químico (cloreto de cálcio)
Eletroporacao (corrente elétrica)

Question 14

Bactéria E.Coli

Answer 14

Genoma circular
Gram negativa: tem parede ext e int
Não tem peptidoglicano

Question 15

Bactérias gram positivas

Answer 15

Não podem ser usadas para inserir plasmideo

Question 16

Método químico (cloreto de cálcio)

Answer 16

A membrana e o plasmideo tem cargas negativas por isso repelem-se
O cálcio vai forrar a membrana da bactéria e o plasmideo, permite assim aproximação
Choque térmico: aquecimento a 42º, aumenta fluidez, aumenta permeabilidade

Não é eficiente

Question 17

Eletroporacao (corrente elétrica)

Answer 17

Forma buracos na membrana

Mais eficiente

Question 18

Colonia

Answer 18

Conjunto de bactérias geneticamente iguais com o mesmo plasmideo (clones)

Question 19

Purificação das proteínas

Answer 19

Por chromatografia de afinidade

Question 20

Transfecao

Answer 20

Inserção de plasmideo recombinante em células Eucarioticas

Métodos físicos
Vírus
Vesículas lipídicas (lipossomas)

Question 21

Métodos físicos

Answer 21

Microinjecao: micropipeta em embrião

Gene guns: nano balas na parede celular de células vegetais

Question 22

Vírus

Answer 22

Infetam células com RNA