Aula 14 - MLPA E Microarrays Flashcards
MPLA (Multiplex ligation probe amplification)
Variação de PCR
Permita:
Análise de muitas sequências de DNA numa única reação PCR
Determinar altercoes no número de cópias de seq específicas de DNA e RNA
Deteção de quantidade relativa de sequências alvo
Desnaturação e hibridacao
Sondas constituídas por 2 hemisondas (sequência de hibridacao + região constante + sequência stuffer)
Ligase termoestavelune as duas hemisondas
Amplificação das sondas por PCR: quebra das pontes de hidrogénio
Cada sonda tem um comprimento único
Primers, um so par
Fluorocromo no primer , visualização de picos
Eletroforese capilar
Racio
Possível detetar:
micro delecoes
Microinsercoes
Mudança de um único nucleotideo
Kits de sondas
Sondas para um único gene: verificar se há ganho ou perda de exoes
Sondas Lara cromossomas: verificar se há ganho ou perda de cromossomas
Reverse transcriptase MLPA
Análise de expressão genica e detetar genes on e off
Extração do mRNA
Conversão em cDNA
De resto é tudo semelhante a MLPA
Ligase-65 usada no MLPA não consegue ligar sondas associadas a RNA
Methylation specific MLPA
estudo e metilacao em genes
Avaliação do imprinting genomico
2 reações:
DNA sem metilacao- MLPA normal
DNA com metilacao: endonuclease HHA1 digere o DNA não metilado
Rácio entre metilacoes e não metilados
Microarray de ácidos nucleicos
Sequências dispostas sobre lâmina
Permite avaliar: delecoes e duplicações e expressão genética
Selecionar segmento de DNA
PCR
amostras impressas nas lâminas
São conhecidas a seq e a posição exata de cada sonda no chip
Múltiplos oligonucleotideos de DNA sintetizados in situ a partir de nucleotideo inicial ligado covalentemente a lâmina
Quanto mais densa maior a cobertura do genoma
Extração do mRNA Transcrição reversa Marcação dos cDNA Hibridacao dos cDNA com o microarray Análise de intensidade de fluorescência
Microarray based comparative genomic hybridisation (array CGH)
Utiliza DNA cromossomico para analisar mutações no DNA
Microarray de proteínas
Microarray de tecidos
