Aula 23 - Manipulação Genética

Question 1

Gene Knockin

Answer 1

Alteração de sequência sem impacto na expressão

Question 2

Gene knockout

Answer 2

Gene sem expressão

Question 3

Gene overexpression

Answer 3

Níveis de expressão anormalmente elevados

Question 4

Ectopic gene expression

Answer 4

Expressão em células que normalmente não expressam o gene em causa

Question 5

Gene misexpression

Answer 5

Expressão temporal errada

Question 6

Gene sob o controlo de um promotor induzivel

Answer 6

Pode ser ligado ou desligado

Question 7

Mutações dominantemente negativas

Answer 7

Expressão de proteínas mutantes não funcionais

Question 8

Mutagenese de genes

Answer 8

Por substituição inserção ou delecao

Question 9

Manipulação da expressão genética

Answer 9

LOF: ablação do gene, indução da degradação do mRNA, inativacao da proteína

GOF: expressão ectopica

Atuação em:

DNA: ablação/introdução do gene
mRNA: silenciamento usando RNAi
Proteína: sequestração usando anticorpos ou proteínas recombinantes

Question 10

Eletroporacao

Answer 10

Introdução de DNA recombinante (plasmideo) nas células por campo elétrico
Dependendo do plasmideo pode acontecer gof ou lof

Question 11

Microinjecao de DNA recombinante em embriões celulares

Answer 11

Ratinhos transgenicos: cópias múltiplas do transgender são inseridas em locais desconhecidos e aleatórios do genoma

Desvantagens:
Mutagenese
Alguns transgenders podem ficar sob controlo de diferentes genes
Níveis de expressa dependentes do número de cópias

Question 12

Processo de mutar ratinhos I guess

Answer 12

Transfere injectado no pronucleo de ovo antes de fusão
10/30% da descendência tem DNA recombinante
Ratinhos testados por southern blotting e ou PCR de DNA isolado
Cruzamento deles até produzir linhagens puras

Question 13

Recombinacao homologa em células estaminais embrionárias (ES cells)

Answer 13

Knockins knockouts knockouts condicionais knockouts induziveis
Transgene inserido num local genomico definido

Question 14

Knockout pt 2

Answer 14

Gene neor + gene reporter

Gene Neor: confere resistência a G418 (antibiótico neomicina) - seleção positiva

Question 15

Ratinhos knockout

Answer 15

Gerados por recombinacao homologa
Plasmideo ko inserido na ES cells por eletroporacao (transfecao)
Inserção de DNA recombinante leva a delecao ou interrupção de gene
ES cells injetadas no estádio de blastocisto
Acasalados entre si para produzir ratinhos homozigoticos knockout

Question 16

Knockouts condicionais

Answer 16

Sistema cre lox
Permite interrupção de expressa ode um dado gene somente num tipo de tecido
Lox P - local específico para ocorrência de recombinacao
Cre recombinase- enzima q catalisa recombinarão entre 2 locais loxP