Aula 3 - Análise E Localização De Ácidos Nucleicos E Proteínas

Question 1

Carga do DNA

Answer 1

Negativa devido à presença de ácidos fosfóricos

Question 2

Eletroforese

Answer 2

Aplicar corrente elétrica
Separa moléculas de DNA em função do seu tamanho
Campo elétrico constante
Quanto menores mais rápido migram

Question 3

Corante de DNA

Answer 3

Brometo de etidio: fluorescente em UV, perigoso

Corante inócuo: fluorescente com coloração verde, seguro

Question 4

Gel de agarose

Answer 4

Quanto menores mais rápido migram olecula
Vão para o polo positivo (vermelho)

> concentração - > resolução

Question 5

Gel de policrilamida

Answer 5

Permite separar moléculas de DNA mais pequenas e com massas moleculares muito próximas

Utilizado nas primeiras sequenciacoes

Question 6

Eletroforese capilar

Answer 6

Técnica de sequenciacao mais recente

Question 7

Enzimas de restrição

Answer 7

Endonucleases
Cortar DNA de modo NÃO aleatório
Existem naturalmente em bactérias

HPA1 - não deixa sequências coesivas
EcoR1 - deixa 2 extremidades coesivas de cadeia simples

Importantes para técnicas de DNA recombinante

Question 8

Hibridização do DNA

Answer 8

diminuição gradual da temperatura

Question 9

Sondas

Answer 9

Oligonucleotideo
Complementar a seq de interesse
Marcado logo torna visível

Question 10

Southern blotting

Answer 10

Transferência de moléculas de DNA separadas por eletroforese para um filtro (nitro celulose ou nylon)

Elétrica ou passiva

Question 11

Marcação de sondas

Answer 11

Radioativamente
Com grupos de fluorescência (fluoresceina FITC, rodamina)
Com grupos químicos (digoxigenina, biotina)

Question 12

Autoradiografia

Answer 12

Permite detetar radioisotopos

Question 13

Radioisotopos

Answer 13

Radioativos
Não visíveis mas emitem radiação (desintegração radioativa)

Mais usado: fósforo radioativo, tempo de semivida curto, perigoso, emite radiações muito energéticas

Question 14

Anemia falciforme

Answer 14

Eritrocitos ganham forma não funcional
Forma de foice

Mutação no gene que codifica cadeia beta da hemoglobina

Adenina substituída por timina

Perda de sequência identificada por enzima de restrição MST2

Question 15

Diagnóstico da anemia falciforme

Answer 15

Isolamento de DNA
Digestão com enzima MST2
Eletroforese
Southern blotting
Sonda

Indivíduo normal- 1,1 kbase
Indivíduo mutante- 1,3 kbase

Question 16

Hibridacao in situ

Answer 16

Localiza diretamente no tecido
Usa sondas marcadas

Cromossomas- após desnaturação do DNA

Question 17

Chromosome painting

Answer 17

Usam sondas fluorescentes
Identificar regiões cromossomas em metafase

FISH

Question 18

FISH (fluorescence in situ hybridisation)

Answer 18

Sonda marcada com dioxigenina, identificada com anticorpo específico

Ex: Presença de telomeros, centromeros, e de outras seq ao longo dos cromossomas

Question 19

Northern blotting

Answer 19

Transferência de moléculas de RNA separadas por eletroforese para superfície do filtro
Pode usar sondas complementares

Question 20

SDS page

Answer 20

Dodecilsulfato de sódio - Eletroforese em gel de poliacrilmida

Question 21

SDS

Answer 21

Dodecilsulfato de sódio 
Detergente ionico desnaturante
Carga negativa 
Elimina carga e forma:
Uma molécula de detergente ( ligação peptidica)

A sua carga negativa repele a da proteína, desnaturando-a (linearizam)

Confere carga negativa

Question 22

Molécula redutora

Answer 22

Quebra ligação dissulfureto
Promove linearização

Ditiotreirol (DDT) e beta mercaptoetanol

Question 23

PAGE

Answer 23

Eletroforese em gel de poliacrilamida

Géis verticais

Proteínas com carga negativa vão para polo positivo

Question 24

Glicerol (em SDS PAGE)

Answer 24

torna amostra mais densa

Question 25

Azul de bromofenol (em SDS PAGE)

Answer 25

Migra a frente das proteínas

Permite observar evolução

Question 26

Corantes de SDS PAGE

Answer 26

azul de coomassie

Nitrato de prata (mais sensível)

Question 27

Soluções de aminoácidos

Answer 27

Grupo carboxilico: carga negativa
Grupo amina: carga positiva

Proteína: globalmente neutra

Ph inferior: carregada positivamente
Ph superior: carregada negativamente

Question 28

Ponto isoeletrico

Answer 28

Valor de ph em que proteína está neutra

P.I mais baixo : mais grupos negativos
P.I mais alto: mais grupos positivos

Question 29

Focagem isoeletrica

Answer 29

Separação de proteínas em função do Ponto isoeletrico

Proteína deixa de migrar quando chega ao PI

Question 30

Eletroforese bidimensional

Answer 30

SDS PAGE + focagem isoeletrica

Question 31

Western blotting

Answer 31

Após SDS PAGE transferir proteínas para membrana de alta afinidade (nitrocelulose) para determinar presença

Não pode ser passiva, tem de ser por aplicação de corrente elétrica

Question 32

Corante ponceau S (em western blotting)

Answer 32

Cor de rosa
Liga a todas as proteínas
Na membrana de nitrocelulose

Question 33

Imunocitoquimica/ imunoblotting

Answer 33

Usam anticorpos após western blotting

Question 34

Anticorpos

Answer 34

Grande especificidade para proteina

Primário: ligação antigenio-anticorpo
Secundário: liga a anticorpo primário

Question 35

Tipos de imunocitoquimica

Answer 35

Direta: usa só anticorpo primário, usa fluorocromo ou outra enzima

Indireta: usa anticorpo primário e secundário, mais sensível

Question 36

Fosfatase alcalina e peroxidase

Answer 36

Fosfatase alcalina: azul escuro

Peroxidase: castanho escuro

Question 37

Imunocitoquimica ulta-estrutural

Answer 37

Usa partículas eletrodensas+ anticorpos

Permite identificação de proteínas através de TEM

Question 38

Southern blotting (resumo)

Answer 38

DNA

desnaturação prévia

Sondas

Question 39

Northern blotting (resumo)

Answer 39

RNA

Já estão em cadeia simples

Sondas

Question 40

Western blotting (resumo)

Answer 40

Proteínas

Transferência ativa

Anticorpos