Aula 7 - Clonagem E PCR Flashcards
Vetores
Meio de suporte para o dna a clonar
Plasmideos
Moléculas de dna circulares, extracromossomicas e com capacidade de autoreplicação
Enzimas de restrição
Endonucleases
Permitem introdução de DNA no plasmideo
Clivam o DNA nos locais de reconhecimento
O corte pode ser feito:
No eixo de simetria: blunt ends
Em escada: sticky ends
Transformação bacteriana
Introdução dos plasmideos na bactéria E.coli
Método químico: adução de CaCl2
Eletroporacao: aplicação de campo elétrico que produz buracos na membrana por onde entra o DNA
Annealing
Ligação de primers as regiões complementares de DNA molde
Extensão
Adição de desoxirribonucleotideos (dNTPs), formando cadeia complementar de DNA com recurso a TaqPolimerase
Temperatura de desnaturação
94 a 96
Quebra da dupla cadeia de DNA
Temperatura de annealing/melting
50 a 60
Dependendo do primer
Temperatura de extensão
72
Temperatura ótima de atuação de Taqpolimerase
Quantos ciclos?
30 a 35
A partir do 3 ciclo obtém-se fragmentos que correspondem exatamente a zona de interesse
No fim da extensão a enzima para de adicionar nuc devido à aumento de temp
Fases do PCR
Fase exponencial- o produto é duplicado a cada ciclo
Fase linear- diminui velocidade, reagentes vão sendo consumidos
Fase de plateau- sao atingidos 30 ciclos, deteção no end point
Eletroforese (em PCR)
Para verificar
Em gel de agarose
Brometo de etidio
Variantes do PCR
PCR multiplex PCR fluorescence PCR multiplex fluorescence Real time PCR PCR Multiplex real time
PCR multiplex
Uma única reação
Primers com temperaturas de annealing semelhantes
PCR fluorescence
Primers com fluorocromos
Eletroforese capilar (sequenciador automático)
Laser captura fluorescência
Observam-se ricos em vez de bandas
