Aula 7 - Clonagem E PCR Flashcards
Vetores
Meio de suporte para o dna a clonar
Plasmideos
Moléculas de dna circulares, extracromossomicas e com capacidade de autoreplicação
Enzimas de restrição
Endonucleases
Permitem introdução de DNA no plasmideo
Clivam o DNA nos locais de reconhecimento
O corte pode ser feito:
No eixo de simetria: blunt ends
Em escada: sticky ends
Transformação bacteriana
Introdução dos plasmideos na bactéria E.coli
Método químico: adução de CaCl2
Eletroporacao: aplicação de campo elétrico que produz buracos na membrana por onde entra o DNA
Annealing
Ligação de primers as regiões complementares de DNA molde
Extensão
Adição de desoxirribonucleotideos (dNTPs), formando cadeia complementar de DNA com recurso a TaqPolimerase
Temperatura de desnaturação
94 a 96
Quebra da dupla cadeia de DNA
Temperatura de annealing/melting
50 a 60
Dependendo do primer
Temperatura de extensão
72
Temperatura ótima de atuação de Taqpolimerase
Quantos ciclos?
30 a 35
A partir do 3 ciclo obtém-se fragmentos que correspondem exatamente a zona de interesse
No fim da extensão a enzima para de adicionar nuc devido à aumento de temp
Fases do PCR
Fase exponencial- o produto é duplicado a cada ciclo
Fase linear- diminui velocidade, reagentes vão sendo consumidos
Fase de plateau- sao atingidos 30 ciclos, deteção no end point
Eletroforese (em PCR)
Para verificar
Em gel de agarose
Brometo de etidio
Variantes do PCR
PCR multiplex PCR fluorescence PCR multiplex fluorescence Real time PCR PCR Multiplex real time
PCR multiplex
Uma única reação
Primers com temperaturas de annealing semelhantes
PCR fluorescence
Primers com fluorocromos
Eletroforese capilar (sequenciador automático)
Laser captura fluorescência
Observam-se ricos em vez de bandas
PCR multiplex fluorescence
Vários primers marcados com diferentes cores
Separa por tamanhos e cores
Eletroforese capilar: maior resolução ( permite distinguir fragmentos que diferem numa base)
Adiciona-se o standards de tamanhos
Single template PCR reaction
Um único molde amplifica várias sequências (vários primers)
Multiple template PCR reaction
Vários moldes amplificados apenas por um conjunto de primers ou por vários primers
Metodologia do SYBR
SYBR green: marcador fluorescente que se vai intercalar na cadeia dupla de DNA ( absorve azul e emite verde)
Quantidade de luz verde registrada
Real time PCR
Calcular número de moléculas que vão sendo sintetizadas:
Metodologia SYBR
Metodologia sondas Taq
Metodologia sondas Taq
Sonda oligonucleotidica que se liga a cadeia de DNA complementar entre primers forward e rever-se
Reporter fluorescence na extremidade 5’
Quencher (supressor) na extremidade 3’
Técnica baseada no princípio FRET
Sonda intacta: fluorescência emitida por reporter é absorvida por Quencher
Extensão: atividade exonuclease da Taq polimerase 5’->3’ parte sonda, separa repórter e quencher
Deixa de haver transferência de energia
Libertação de fluorescência pelo reporter
Deteção pelo aparelho
Real time PCR multiplex
Só é possível usando sondas TaqMan
Gene A- sonda tem repórter marcado a verde
Gene B- sonda tem repórter marcado a azul
SYRB vantagens e desvantagens
Mais economico
Ligação não especifica do corante
TaqMan vantagens
Maior especificidade
Uma única reação (multiplex)
Desv: ver sebenta pg 83
Based line
Fluorescência basal que o aparelho registra sempre
Ruido
Linha de threshold
Linha a partir da qual a fluorescência superior a basal
Ciclo de threshold
Ciclo a partir do qual houve registro de fluorescência válido
