9. Markører og koblingsundersøgelser Flashcards
Mikrosatelitter (STR)
Sekvens 1-6 nukleotid gentagelse
Antal gentagelser afhænger af lokus og allel
Biparentale/maternelle/paternelle
Single nucleotide polymorphisms: SNP
DNA-markør.
Enkelt nukleotid i sekvens varierer.
Lokus afhængig - nogle lokus har T andre C
1:1000
Forskellen mellem STR og SNP
Forskellen mellem de to markørtyper er i deres DNA-sekvens, hvor SSR-markører består af gentagne sekvenser, og SNP-markører består af en enkelt nukleotidvariation. Derudover kan SSR-markører have flere alleler på samme locus, mens SNP-markører kun kan have to. SNP-markører er normalt mere stabile og mindre tilbøjelige til at mutere end SSR-markører.
Hvilke genotypingsmetoder anvendes til SNP og STR?
SNP-markør: Genotypes ved SEKVENTERING – læser rækkefølgen af baser, og det noteres om der på
markørnukleotidet findes et C eller et T.
SSR-markør: genotypes vha PCR og GELELEKTROFORESE.
Først PCR-amplifikation vha primere, som annealer på hver sin side af mikrosatellitten. PCR-produktets størrelse (i basepar) afhænger derfor af, hvor mange repeats denne mikrosatellit har hos dette individ. P
Princippet i en koblingsundersøgelse
Princippet i en koblingsundersøgelse er at der først esker en DNA indsamling fra en røkke indivder der enten er relaterder til hiannde familie eller sygdomsmæssigt. I koblingsundersøgelsen laves der nu genotyping mod raske/syge individe rog der undersøges for enten SNP/STR markører om der er tale om nogen form for kobling der strider mod nulhypotesen om uafhængig til tilfældig nedarvning.
Hvordan laves koblingsundersøgelser principielt
DNA prøve indsamling
Genotyping af SNP/SSR ift. sygdomsgen
Koblingsanalyse
,
,
.
For at udføre en koblingsundersøgelse indsamles DNA-prøver fra en gruppe individer, der er relateret på en bestemt måde (for eksempel familier med en bestemt sygdom). Genotyping udføres på disse prøver ved hjælp af SNP- eller mikrosatellitmarkører. Ved at analysere overførslen af allelerne af disse markører fra forældre til afkom kan man bestemme, om de to markører er koblet (tæt på hinanden) eller ikke-koblet (på forskellige kromosomer).
Afgør om en given markør er informativ og koblet til et sygdomsgen
For at afgøre, om en given markør er informativ og koblet til et sygdomsgen i en familie, udføres en koblingsanalyse ved hjælp af genotyping af familiemedlemmerne.
En markør anses for at være informativ, hvis det kan skelne mellem de forskellige allel-kombinationer af et gen, som er relevante for den pågældende sygdom. Med andre ord, hvis en markør er polymorf, dvs. at den har forskellige alleler, og disse alleler er til stede i forskellige kombinationer i familiemedlemmerne, kan den anvendes som en informativ markør.
Koblingsanalyse indebærer genotyping af familiemedlemmerne og bestemmelse af, hvilke allel-kombinationer af markøren der er til stede sammen med sygdomsallelen. Hvis markøren er tæt på sygdomsgenet, vil de to gener ofte blive overført sammen til den næste generation. Dette betyder, at hvis et familiemedlem har en bestemt kombination af alleler for markøren og også har sygdommen, så vil denne kombination være overrepræsenteret i den pågældende familie sammenlignet med en normal befolkning.
Koblingsanalysen giver en koblingsværdi, der beskriver sandsynligheden for, at markøren og sygdomsgenet befinder sig tæt på hinanden på samme kromosom.
En høj koblingsværdi indikerer en højere sandsynlighed for, at markøren og sygdomsgenet er tæt på hinanden.
En koblingsværdi på 0 indikerer, at markøren og sygdomsgenet er uafhængige af hinanden og sandsynligvis befinder sig på forskellige kromosomer.
Ved at bruge flere markører kan man opbygge et koblingskort, der kortlægger placeringen af sygdomsgener og andre arvelige træk på kromosomerne. Koblingsanalyser kan hjælpe med at identificere potentielle sygdomsgener og forstå arvegangen af en sygdom i en familie.
Beskrive hvorledes man kan komme fra fænotype til kloningen af et gen (positionel kloning, jf. 12.4)
Trin1: genom scan
Trin 2: Identificerer kandidat gener
Trin 3: Kloning og karakterisering
Trin 1 i kloningen af et gen (genom scan)
Fra fænotype til kloning af et gen
Første trin fra fænotype til klonign i et gen er at slave en koblingundersøgeælse for fænotypen mod raske. Hertil anvendes polymorfe markører 1 pr. 20 C.M. Der anvenss enten SNP/STR nmarkeær. Koblingsundersøgelsen vil måske individer visse SNP markører har stor koblingsuligevægt med fænotypen/sygdommen og derfor laves nu en finmapning af denne region for at undersøge efter muligt sted for sygdomsgen, da markøren i sig selv ikke er årsagen til sygdommen.
Trin 2 i kloning af et gen (Identificer kandidatgener)
Fra fænotype til kloning af et gen
I trin 2 undersæges der kandidatgener.
Bruger Computer analyses til at undersøge exons og åbne læserammer i et gen pg sammenligner cDNA sekvensenr med forskellige arter for at kortlægge exons.
Trin 3 i kloning af et gen (Kloning og karakterisering)
I tredje trin i kloning og karakterisering er der tale om at finde ud af om genet er ansvarligt for fænotypen.
Man kigger her på:
*Ekspressionsmønster
*Forskel ml. syge og raske
*Sekvensforskelle
*Genmodificering i dyr
Forklare hvordan gen-editering kan bruges til gen-funktionsanalyse
Man bruger geneditering som CRISPR/CAS9 til at introducerer det mulige sygdomsmutation i genetisk rask og ‘normalt’ dyr.
Fremtræder sygdommen efter geneditering er genet/mutatioen årsag - hvis ikke ledes der videre.
Forklar hvordan princippet i koblingsundersøgelser også kan bruges til kortlægning af gener involveret i en kvantitativ egenskab
Typisk normalfordeling af egenskab i populationen
Alleler med betydning for kvantitative egenskaber kan kortlægges ved at undersøge for kobling mellem markører og gener med betydning for egenskaben
Gener med stor betydning for en kvantitativ egenskab kaldes Major gener
Regioner med gener kan identificeres ved hjælp af kobling til markører
Koblingsuligevægt
Koblingsuligevægt (engelsk: Linkage disequilibrium, LD) er et begreb, der beskriver den statistiske sammenhæng mellem to eller flere genetiske variationer (f.eks. SNP’er) på samme kromosom. Det vil sige, at hvis to genetiske variationer på samme kromosom ikke er uafhængige af hinanden, men i stedet er koblede er der koblingsuligevægt mellem dem.
Haplotype blokke
Haplotypeblokke beskriver områder af kromosomer, hvor der er stor koblingsuligevægt mellem de genetiske variationer.
Haplotypeblokke kan have betydning i genetisk forskning og diagnostik, fordi de kan anvendes til at identificere områder af kromosomer, der er ansvarlige for bestemte egenskaber eller sygdomme. Haplotypeblokke kan også anvendes til at forudsige, om en person har øget risiko for at udvikle en bestemt sygdom, baseret på de genetiske variationer, der er til stede i haplotypeblokkene.
