7. DNA analyse Flashcards
Princippet i genelektroforese
Adskillelsesprocess - sorterer efter størrelse og ladning
Gel, elektroder, DNAs ladning, huller, størrelse og hastighed
Princippet i PCR
DNA, DNA polymerase, L og R primerere, dNTP’er (4 forskellige)
Denaturering (95) bryder hydrogenbind.
Annealing (55-65) primere
syntetisering (72) DNA polymerase, nukleotider, byggesten i 5-3 retning. 30 cyklus = 1 cyklus fordopler DNA mængde eksponentielt.
Restrikriktionsenzymer stammer fra
Bakterier.
Forsvarsmekanisme mod fremmed DNA
Mekanisme: genkender og skærer i specifikke DNA sekvenser (restriktionssites). Forskellige restriktionsenzymer genekden forskellige sekvenser. typisk 4-8 baser langt.
Undersøger DNA for kendte mutatioenr da de genkender specifikke basesekvenser.
To eksempler på restriktionsenzymer
Eks: RsaI genkender 5-GTAC-3
skærer GT/AC
palindromer = enzymer skræer begge sider af DNA sekvensern
EcoRI 5-GAATTC-3
skærerer G/AATTC
enzymer skærer begge dna strenge ml G/A. klipper ikke midt i dna sekvensen = forskudt klipning = lille enkeltstrenget stykke = Overhands/sticky ENDS!
Princippet i genotyping
genotyping bestemmer persons genom og involverer teknikker som PCR, sekventering og SNP-genotyping
Kloning, formål og fremgangsmetoden
Definition: At lave en genetisk identisk kopi.
Formål:
Amplifikation/opbevaring af store DNA fragmenter, der er for store til at opformeres i PCR.
Ekspression af proteiner som insulin, osteløbe el. antibiotika
Kloningsprocessen
Isolering af DNA-fragment: Det ønskede DNA-fragment isoleres fra kilden, fx ved at anvende enzymer, der kan skære DNA’et i bestemte steder.
Ligering: Vektoren åbnes med et restriktionsenzym. Er Insert DNA’et klippet med samme enzym dannes komplimentære overhanks så de passer sammen. Insert og vektor sammenføjes af ligase og danner en rekombinant cirkulært DNA molekyle.
Er Insertet et c-DNA molekyle har det ingen overhanks og kan ikke overlappe præcist med vektoren.
Transformation: Den rekombinante vektor med insert indføres i en værtscelle (alm. E. coli).
Cellerne udsættes for chok (strøm) hvilket kortvarigt øger permeabiliteten så DNA’et optages af værtscellen via små porrer i membranen. Nogle bakterier optager kun plasmider uden DNA insert og skal derfor selekteres fra.
Selektion: Efter indførelsen af vektoren i værtscellen skal man sikre sig, at den ønskede DNA-sekvens er blevet indsat i vektoren. Dette sker ved at udvælge værtsceller, som har optaget den ønskede vektor og replikeret det indsatte DNA-fragment, mens de samtidig har afvist alle andre vektorer.
Opbygningen af en vektor (bakterie)
PRARS
(P)rimersite
(R)estriktionssite
(A)ntibiotikaresistensgen
(R)eplikationsstart
(S)elektionsmarkør (lac-Z)
Overhanks
Først åbnes vektorene med restriktionsenzym. er insert dnaet klippet med samme enzym = komplimentære overhanks.
Kloningsprocess: Forklar kort ligering, transformering og selektion
1) Ligeringen indsættes DNA-fragmentet i vektoren. Først åbnes vektoren med et
restriktionsenzym, og DNA-fragmentet/insertet og vektoren sammenføjes med ligase.
Vektor + insert = rekombinant.
2) Transformering: vektor indsættes i værtscelle – typisk E.coli. Vektormolekyler og bakterier blandes, og bakterierne gøres permeable (CHOK/STRØM), så de kan optage vektormolekylerne.
3) Bakteriekolonierne opformeres til sidst på en agarplade med x-gal. Vektoerer uden insert vil forårsage at bakteiren kan nedbryde stof på pladen og farves blå. I de rekombinante vektorer er lac-Z genet ufunktionelt og kolonien forbliver hvid.
Hvordan skelnes ml. tomme og rekombinante vektorer i bakterier?
svar: SELEKTIONSMARKØR GEN
Tom vektor = Lac-Z gen som spalter laktose på agarpladen = blå.
Rekombinant vektor = lac-Z gen ufunktionelt pga. insertion = hvid.
Kloning: ekspression af gener:
KLONING: Ekspresion af gener i værtscelle:
c-DNA i vektor - værtscelle.
Vektorer med replikationsstart og antibiotika resistens + bakteirespecifikke regulatoriske sekvenser (promoter, transkriptionsstart/stop).
Der vil konstant udtrykkes proteiner/gener i bakteriecellen.
Princippet i DNA sekventering
DNA sekventering (to trin). Formål: Forudsige aminosyresekvens for mutationer på tværs af arter.
1) PCR med DDNTP (terminator nukleotider med flouriserende stof). DDNTP mangler hydroxygrupep på 3C = ikke flere nukleotider.
Under PCR dannes tusinde sekvenser der stopper tilfældigt = 1. 1,2. 1,2,3. 1,2,3,4..
2) Aflæsning på akrylamidgel og laser.
Flouriserende DDNTP = farverækkefølge.
Forklaring af cDNA syntese og analyse
Hvis gener er for lange til PCR bruges cDNA syntese.
Genet transkriberes til mRNA = godt fordi: finde mutationen, bestemme protienets aminosyresekvens, måle mængde af mRNA.
mRNA er skrøbeligt = % PCR. Omdannes til cDNA (DNA af mRNA) via revers transkriptase. Dens PolyT primer annealer med alle mRNA haler og nukleotider.
Syntese sker i 3’-5’ retning. RNA-ase fjerner mRNA fra cDNA = enkeltstrenget cDNA. PCR på cDNA = isolering og amplificering, derefter sekventering.
Skal der klones på cDNA skal der alves en dobbeltstrenget cDNA ved at DNA sekvensen laver et loop der bøjer om sig selv. Polymerasen kan fortsætte med syntese pga loop og loopet skæres af efter syntese.
Forklar cDNA princip
cDNA står for “complementary DNA” og er en enkeltstrengs DNA-kopi af en messenger RNA (mRNA) molekyle. Princippet i cDNA-syntese er at konvertere mRNA til cDNA ved hjælp af enzymet reverse transcriptase.
Først isoleres mRNA fra celler eller væv, og derefter bruges reverse transcriptase til at syntetisere den enkeltstrenget cDNA ud fra mRNA-molekylet. Reverse transcriptase bruger mRNA som skabelon og syntetiserer et komplementært DNA-streng ved at tilføje nukleotider
Efter cDNA-syntese kan cDNA’et amplificeres ved hjælp af polymerase chain reaction (PCR) og derefter anvendes i en række applikationer, såsom genudtryksanalyse, kloning og sekventering. En fordel ved cDNA er, at det kun indeholder genernes kodende regioner og ikke de ikke-kodende introns, som normalt findes i DNA fra en celles genom. Dette gør cDNA velegnet til at analysere generes udtryk og struktur.
qPCR princip
qPCR / kvantitativ PCR måler mRNA mængde i prøve.
mRNA omdannes til cDNA. cDNA opformeres i PCR. Specifikt flouriserende probe bindes til mutation/markør for genet = flourisens.
Maskinen detektere lysintensitet.
Ct-værdien er det antal cyklusser, der skal til, før niveauet af genet når tærskelværdien.
