ZKT Flashcards
Zelllinien
Kryokonservierung
Langsam: zu viele Elektrolyte ez –> grosse Kristalle und starke Dehydrierung
Schnell: kleinere Kristalle und weniger Dehydrierung.
DMSO(Dimethylsulfoxid)
Führt zu kleineren und weniger Kristallen und weniger Membranschäden.
Es reduziert das osmotische Gefälle und verhindert eine Dehydration über 30%(lethal).
Diese kleinen Kristalle können migratorisch die Zellen schädigen.
Bei RT zelltoxisch.
Zellgrösse Kryokons.
Grössere Zellen dehydrieren langsamer aber bilden mehr IZ-Kristalle.
Transformation
Übertragen von freier DNA(Plasmid) auf/in eine Prokaryotische Zelle
-Elektroporation
-Calciumchloridmethode
Transfektion
Einführung von DNA in eukaryotische Zelle.
OFt Visualisierung mit GFPs.
CaPO4-Methode
Zellen in log.Phase
DNA fällts als Calciumpräzipitat aus und wird als CaPO4 per endozytose aufgenommen.
Lipofektion
Kationische Liposomen binden die anionische DNA und transportieren diese so in die Zelle.
Grössere DNA-Stücke möglich, aber zelltoxische Adjuvanzien.
Elektroporation
Durch elektrische Impulse wird die Zellmembran temporär durchlässig.
CAR-T-Cells
T-Zellen werden mit chimären Antigen-Rezeptoren auf Krebszellen “abgerichtet”.
Transduktion
DNA Übertragung durch Bakteriophagen oder Viren
CAR-T-Cell herstellung
Zellen “ernten” durch Leukapherese, meist T-Lymph.
Zytokine für die Klonierung und Lenti- oder Gammaretroviren für die “Konditionierung” auf Krebs-AG.
Vorteile CAR-T
Erkennen AG unabhängig von MHCI-Rezeptor. Auch schwach immunogene Zellen/Tumore werden bekämpft.
Solide Tumore sind bis anhin noch nicht gut bekämpfbar. ALLs sind das primäre Ziel.
Side effects CAR-T
CRS: Zytokinfreisetzungssyndrom.
Zeichen für Anschlagen der Therapie aber kann tödlich enden.
Ablauf CAR-T
- Harvest/Leukapherese
- Programming mit Viren
- Klonierung
- QK
- Chemo
- Infusion
- Wirkung
Phytohemagglutinin-L
Pflanzliches Lektin
Agglutiniert mit Oligosacchariden
Regt Mitose von T-Zellen an
In unserem Experiment sollte keine Wirkung nachweisbar sein( erst ab 1 mikrogramm, bei uns sinds max 0.5)
Primärkultur
Zelllinie
Isolation, Explantation im ersten ZK-Gefäss
hTERT-Zellen
Gesunde Zellen, aber infinit.
hTERT = humane Telomerase reverse transcriptase –> verhindert Telomerase-Verkürzung
Mycoplasmen
Interferieren mit Zell-Stoffwechsel
Beispielsweise durch Arginin-Verbrauch –> Histonsynthese gestört –> zytogenetische Defekte und Chr.Aberrationen
Mycoplasmen-Prävention
Oft interkulturelle Übertragung
Quarantäne für neue Linien/Kulturen
Medien/Puffer kontrollieren.
Exogene Kontaminationen beachten (mycoplasmen aus Mund beispielsweise)
Primer Mycoplasmenkit
hochkonserviertes rRNA-Operon (16S rRNA) für Pos. und Plasmid DNA für interne QK.
Formel Zellzählung
Z x VF x V x 10^4
Z= MW
VF= Verdünnungsfaktor
V= Volumen in dem die Zellen resuspendiert wurden
10’4= Kammerfaktor
Calciumchlorid-Methode
Vorwiegend für Transformationen verwendet.
Wirtszellmembran wird in 0.1 M Cacl-Lösung permeabler –> DNA kann eindringen.
Cell Banking
Zellinien werden oft nach 20-30 Passagen verworfen (Gen/Phenotype Drift)
Als Reserve von Primärkultur seed lots einfrieren.
Nutzen ZKT
Toxikologie an Zellen
Impfstoffproduktion
Reduktion Tierversuche?
Tissue Engineering
Reinigungsbereich
Gefliest
Laborautoklav
Spülmaschine
Trockenschränke
Spültisch
Wasseraufbereitungsanlage
Vorbereitungsbereich
Arbeitstisch
Anschlüsse Gas; Wasser-; Elektro
Stauraum
pH-Meter
Magnetrührer
Kühlschrank 4-8
Gefrierschrank -20, TG -80
Direkter Zugang Sterilbereich
Sterilbereich
SWB II
Brutschrank
Wasserbad
Zentrifuge
Umkehrmikroskop
Schränke
Brutschrank
Thermometer (37)
96-Well-Platte mit 100 mikrol. dH20 für Raumbefeuchtung
Reinigung wöchentlich
Schale mit Seife, Wasser, Ethanol, rest nur Ethanol
SWB II
HEPA-Filter
laminarflow(keine turbulenzen, steril)
top down
über 0,4m/s
Strom, UV
Edelstahl
Vakuum
IMDM
Iscoves Modified Dulbeccos Medium
Phenolrot als Indikator
Vitamine, AS, Puffer, Selen, Kaliumnitrat
FBS
GS
Enthält Zytokine, Wachstumsfaktoren und Bildungs/Transportproteine
Sowie Vitamine, Spurenelemente, AS.
Detoxifikation, Osmotisch, mechanischer Schutz
D-PBS
4 Grad
PHospatbuffer salz
Waschlösung
pH stabilisierend
Pen/Strep
GS
Penicillin/Streptomycin
Hemmt gram-neg/pos Bakterien
L-Alanin-Glutamin
KS
Glutamin =Energie
Zellteilungshilfe
Trypsin
GS
Hydrolase aus Pankreas, EDTA, Glucose
Spaltet Carboxylendebindungen von Lysin/Arginin
Trypanblau
RT
Anionischer Diazofarbstoff
Anion bindet an Proteine und dringt nur bei toten Zellen ein.
Jurkat-Zellen
m,14, akute t-zell leukämie
t-lymphoblast
