Uso diagnóstico de anticuerpos Flashcards
Sistema inmune innato
Rápido inespecífico
Cuales son las barreras físicas del sistema inmune
Piel y mucosa
Sistema inmune adaptativo
Lento y específico
Qué célula secreta anticuerpos?
células plasmáticas <– linfocitos B
Células de la inmunidad adaptativa
Linfocitos B- céls plasmáticas
Linfocitos T - como efectores
Para que nos sirven los anticuerpos diagnósticos
Identificar patógenos
Saber los componentes de la sangre
¿Qué es ELISA?
Test inmunológico muy sensitivo
¿Para qué se utiliza ELISA?
Para la detección y cuantificación de:
- Anticuerpos
- Antígenos
- Proteínas
- Glucoproteínas
- Hormonas
Proteína elaborada por las células plasmáticas en respuesta a un antígeno
Anticuerpo
Composición anticuerpo
Se compone de:
* 2 cadenas pesadas (variable, puesta por linfocito B)
* 2 cadenas lígeras (constante)
Cada cadena pesada se une a la ligera mediante puente disulfuros.
¿A qué se une un anticuerpo?
A un solo antígeno específico
¿Para qué el linfocito B pone una cadena pesada diferente?
Es específico a cada parte de un microorganismo
¿Qué tipo de anticuerpos se utilizan?
De origen monoclonal
¿Cómo se logra realizar un ELISA?
Realizando complejos antígeno-anticuerpo
Cómo funciona la técnica ELISA
detecta antígenos específicos con anticuerpos marcados
Molécula ajena o tóxica para el organismo que, una vez dentro del cuerpo, induce en éste una respuesta inmunitaria
Antígeno
¿Qué provocan los antígenos dentro del cuerpo?
Formación de anticuerpos
¿Qué se requiere para realizar un ELISA? (4)
Anticuerpos primario y/o secundario
Antígeno
Buffer
Cromógeno o sustrato
Pasos generales para realizar un ELISA (4)
- Recubrimiento
- Bloqueo
- Detección
- Lectura final
¿Con qué se hace el recubrimiento?
Con un antígeno o anticuerpo
¿Con qué se hace normalmente el bloqueo?
Con la adición de albúmina de suero bovino [BSA]
¿Para qué sirve el bloqueo?
Para evitar que en las incubaciones se unan a la placa, de forma inespecífica otras moléculas que podrían interferir con los resultados
ELISA directo
- El antígeno se inmoviliza sobre una placa
- Se añaden anticuerpos primarios antígeno de interés con una enzima
- Se pone el sustrato de la enzima para que reaccione–> señal visible (cambia color)
- Ciclos de lavado intermedios
Funciones de la ELISA directo
Analizar la respuesta inmunológica
Baja sensibilidad
Mucho ruido de fondo ya que las proteínas y antígenos se quedan en el fondo
ELISA indirecto
- Se inmoviliza el antígeno sobre una placa
- Se pone un anticuerpo primario antígeno de interés (sin marcar) (sin la enzima)
- Se pone un anticuerpo secundario para el primer anticuerpo marcado con la enzima
- Se añade el sustrato reacciona con la enzima y te da una señal visible
- Ciclos de lavado intermedios
Ventajas ELISA indirecto
Mayor sensibilidad
Proceso más tardado
Reacciones cruzadas
Determinar la concentración total de anticuerpos en la muestra
ELISA tipo sándwich
- El anticuerpo de captura se inmoviliza
- Se añade el antígeno de interés–> se une al anticuerpo de captura
- Se añade un anticuerpo de detección
- Se añade un anticuerpo secundario marcado con la enzima
- Ciclos de lavado intermedios
Ventajas de la ELISA tipo sándwich
Análisis de muestras complejas
Alta sensibilidad y especificidad
Tipo de ELISA más simple y rápido
ELISA directo
¿Por qué ELISA directo tiene un uso limitado?
Por su menor sensibilidad y la dificultad para obtener un conjugado que reconozca directamente al antígeno
¿Para qué sirven los controles?
Para saber que la muestra se realizó correctamente
Para qué se usa una citometría de flujo?
Identificar y cuantificar diferentes poblaciones celulares en suspensión
Qué son los cluster of differentiation?
antígenos en la membrana celular
específicos para la célula o su linaje
Cómo funciona la citometría de flujo?
Marcan CD con anticuerpos
las células pasan una por una en solución por un laser
Dispersa el láser dependiendo del tamaño de la célula y sus proteínas expresadas (marcadas con anticuerpos)
Ejemplos de aplicaciones de la citometría de flujo
Leucemias
Seguimiento de VIH
linfomas
IgM
Respuesta a una infección aguda
IgG
Respuesta de memoria
¿Qué es Southern Blot?
Técnica de laboratorio utilizada para detectar una secuencia específica de DNA en una muestra de sangre o tejido
¿A partir de qué se busca el DNA en esta técnica?
A partir de DNA
Enzima que divide al DNA en fragmentos cerca o en de sitios de reconocimiento específicos dentro de moléculas conocidas como sitios de restricción
Enzima de restricción
Otro nombre para la enzima de restricción
Endonucleasa de restricción
¿Dónde se encuentran los sitios de reconocimiento?
Dentro de las moléculas de reconocimiento
¿Qué reconoce la enzima de restricción?
Una secuencia específica de nucleótidos
¿Qué produce la enzima de restricción?
Un corte de la doble cadena del DNA
¿Qué les pasa a los fragmentos de DNA producidos por el corte de la enzima de restricción?
Son separados por electroforesis
Cómo funciona una prueba Southern blot?
aísla DNA
corta DNA con enzimas de restricción
separa secuencias de DNA por electroforesis
transfiere fragmentos de DNA del gel a una membrana de nitrocelulosa
hibridación: añaden sondas marcadas radiactivamente para la secuencia de DNA de interés
se guarda la membrana de nitrocelulosa con una película de rayos-x fuera de la luz para que las sondas radioactivas la marquen
Cuál es la diferencia del northern blot con el southern blot?
El northern blot es para RNA
usa DNAsas antes de la electroforesis
Cuál es la diferencia del western blot con el southern blot?
El western blot detecta proteínas
usa anticuerpos marcados en vez de sondas
Uso diagnóstico de Ac en infección viral
Ver respuesta de paciente a infección como respuesta inmune aguda o de memoria con IGs
¿Qué es Northern Blot?
Técnica de laboratorio utilizada para detectar una secuencia de RNA específica en una muestra de sangre o tejido
¿Qué se usa en esta técnica para encontrar el RNA?
DNA
Pasos para realizar una Northern Blot
Extracción del RNA y separación por electroforesis
Transferencia Northern a una membrana
Hibridación del RNA con una sonda específica
Detección de bandas
¿Qué se necesita hacer para obtener una muestra pura de RNA?
Separarlo de sus otros componentes moleculares (lípidos, proteínas y DNA)
¿Cómo debe estar el gel de agarosa para la separación por electroforesis?
Disuelto en buffer M.O.P.S para estabilizar el RNA , y se le añadirá formaldehído para evitar estructuras secundarias
¿Qué se le añade para que pueda ser visible?
Colorante de carga
Proceso por el cual dos hebras sencillas de DNA, RNA o un híbrido se unen por complementariedad de sus bases nitrogenadas, formando una doble cadena
Hibridación
¿Qué son las sondas?
Ácidos nucleicos sintetizados de cadena sencilla que, por complementariedad de sus bases van a hibridar en la muestra sencilla de RNA de interés
La sonda está marcada para poder detectar al RNA
Tipos de marcaje de sondas
Radioactivo
No radioactivo
Aplicaciones de investigación de northern blot
Monitoreo de la expresión génica y procesamiento de los diferentes RNA´s
Aplicaciones clínicas de Northern Blot
Diagnósticos oportunos para el cáncer
¿Qué es Western Blot?
Técnica de laboratorio utilizada para detectar una proteína específica en una muestra de sangre o tejido
¿A partir de qué se busca la proteína en esta técnica?
Anticuerpos
Pasos para realizar Western Blot
Sustraer las proteínas del tejido deseado (ej. sangre) -> ponerlas en un gel SDS -> separar las proteínas según su peso molecular -> transferir las proteínas a una membrana PVDF (mediante un campo eléctrico o químico, para poder detectar la proteína de interés) -> detectamos la proteína mediante un anticuerpo de forma específica -> una vez unido el anticuerpo a la proteína, se usa algún método de fluorescencia o luminiscencia para detectar la proteína
¿Qué tipo de anticuerpo es utilizado en este estudio?
Monoclonal
