PCR Flashcards
Para qué sirve la PCR
Para obtener grandes cantidades de ADN
Qué hace la PCR?
Sintetiza varias secuencias complementarias de DNA a partir de una secuencia molde
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
Reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de DNA
Reacción en cadena de la polimerasa
¿Qué se necesita para realizar una PCR?
- Secuencia de DNA
- Primers
- DNA polimerasa
- dNTPs
- Buffer/Cofactor
Que polimerasa se usa
Taq polimerasa
Resiste temperaturas de 95 grados
Función de Taq
Polimeriza una cadena de DNA tomando como molde una preexistente
Características que deben tener los primers (5)
Son diseñados por el investigador, buscando que sea complementario a la secuencia buscada
Son cortos
Alto contenido en C y G
No debe ser autocomplementario
No debe formar estructuras secundarias
Es el fragmento de DNA que contiene el gen a buscar
DNA templete
Es lo que determina el inicio y el término de la región que se va a amplificar
Primers
Cuánto deben medir los primers?
De 18 a 24 nm
dNTPs
Desoxirribonucleótidos trifosfatados
Adenina, Timina, Citosina y Guanina
Es una solución amortiguadora necesaria para que la Taq polimerasa haga su función
Buffer / Cofactor
Amortiguador
Es un buffer para regular el PH a 8.4 y funcione Taq polimerasa (neutraliza)
Cofactor cloruro de magnesio
Cofactor de Taq la ayuda en su reacción
Primers de PCR
Diseñados en laboratorio
Proporcionan un extremo 3’ para que inicie la síntesis
Alto contenido de GC
Tipos de primers
Forward 5 a 3 ‘
Reverse 3 a 5’
¿Qué secuencias fortalecen los primers?
GC- guanina citosina
+ difícil que se separen
Fases de la PCR (3)
Desnaturalización
Hibridación
Extensión
Fase donde las cadenas de DNA son calentadas y separadas
Desnaturalización
Temperatura a la que se separan las hebras de DNA
95ºC
Tiempo que tardan las cadenas de DNA en separarse
20 - 30 segundos
Fase donde los primers se alinean al extremo 3´ del templado previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria
Hibridación
Fórmula para estimar la temperatura melting o de hibridación
Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T)
Fase en la que la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-primers y empieza a agregar dNTP´s complementarios para crear las cadenas completas de DNA
Extensión
Dirección en la que es la extensión de las cadenas
5´ a 3´
Temperatura óptima para la reacción de extensión
72ºC
¿Cuántas veces se repiten las fases?
De 20 - 30 veces
Nombre de los equipos donde se realiza la reacción
Termocicladores
¿Cómo verificas que la reacción transcurrió eficientemente?
Debes visualizar los amplicones a través de una electroforesis en geles de agarosa
Por cada ciclo se genera el _____ de hebras
Doble
PCR en tiempo real
Al final de cada ciclo se obtiene la cantidad exacta de ADN de la muestra
Electroforesis
Técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en base a su tamaño y carga eléctrica
Cómo funciona una electroforesis?
genera campo eléctrico alrededor de un gel y separa moléculas de DNA por su tamaño.
Entre más pequeñas viajan más lejos
De qué es el gel para la electroforesis?
agarosa
De qué depende la preparación del gel de agarosa?
Entre más concentrado, más pequeños los poros –> fragmentos de DNA más cortos
Qué se necesita para observar el resultado de una electroforesis?
teñir las muestras para verlas con un transiluminador ultravioleta
Elementos para electroforesis
Camara de electroforesis
Gel de agarosa
Marcador de peso molecular
Transiluminador
Función de cámara de electroforesis
Genera campo eléctrico alrededor de un gel con dos polos que se conectan a una fuente de energía
Cómo funcionan los colorantes para la PCR tiempo real?
no específicos: tienen afinidad por dsDNA y dan señal fluorescente
específicos: sondas fluorescentes de oligonucleótidos
Cómo se puede saber el tamaño de las muestras obtenidas por electroforesis
comparando con marcador de peso molecular
DNA/proteínas de tamaño conocido
Gel de agarosa
Polisacárido extraído de algas marinas, separa fragmentos de ADN de 100 pb a 25 kb
pb= pares de base
¿De qué depende el tamaño de los poros de la matriz de gel?
De la concentración de agarosa es inversamente proporcional al tamaño del poro
¿Cómo se escoge la concentración de agarosa?
De acuerdo al tamaño del ácido nucleico que se va a analizar
Marcador de peso molecular
Mezcla de moléculas de DNA o proteínas de tamaño conocido que permiten comparar el tamaño de las moléculas (ác nucleicos o proteínas) en las muestras sometidas a electroforesis
Qué tipos de PCR existen?
punto final
múltiple
PCR-RFLP
PCR TR
PCR tiempo real
Característica y aplicación de PCR estándar
Amplifica el segmento de ADN con partidores y su detección es mediante geles de agarosa
Detección cualitativa de un segmento de ADN (si está o no)
Característica y aplicación de PCR múltiple
tiene primers para varias secuencias
Amplificación de 2 o más segmentos de ADN utilizando varios partidores en un sola reacción de amplificación.
Detección mediante geles de agarosa
Detecta cualitativamente varios segmentos de ADN
Ejemplo: hallar varias bacterias en una muestra de un paciente
PCR-RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphisms)
PCR estándar pero con paso posterior con enzimas de restricción. Detecta poliformismos genéticos SNPs
PCR -RT
transcriptasa reversa. De RNA a DNA
Reverse transcriptase
Síntesis de cADN a partir de ARN, mediante transcripción reversa y luego una PCR
Función PCR-RT
Expresar genes y detectar virus de ARN
qPCR o PCR tiempo real
observa el resultado de cada ciclo en una computadora. Cuantifica
PCR estándar donde se utilizan tinciones o sondas con fluoróforos para detectar fragmentos amplificados.
Función de qPCR
Detección cualitativa de uno o varios segmentos de ADN.
Se cuantifica el ADN o ver expresión de genes (RT)
Carga viral de virus y bacterias, insulina, miRNAS
En la qPCR los productos amplificados pueden detectarse en cada ciclo
Verdadero
¿Cuál es el método más sensible (específica) para detectar y cuantificar ác. nucleicos?
PCR tiempo real
Detecta pequeña carga viral de un virus
Cuantificación PCR absoluta
Conocer número exacto de copias amplificadas del blanco .
Concentración precisa de ácidos nucleicos en una muestra
Medir la carga viral o bacteriana de un tejido
Cuantificación relativa en qPCR
Evalúa cambios en la expresión de genes en distintos estados fisiológicos
Cambios se basan en los niveles del RNAm del gen blanco comparados con un gen de referencia que no cambia
Tengo 10 miRNAs pero debo tener 20. Ver exceso o déficit
