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Biomol > PCR > Flashcards

PCR Flashcards

1
Q

Para qué sirve la PCR

A

Para obtener grandes cantidades de ADN

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Q

Qué hace la PCR?

A

Sintetiza varias secuencias complementarias de DNA a partir de una secuencia molde

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3
Q

PCR

A

Reacción en cadena de la polimerasa

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4
Q

Reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de DNA

A

Reacción en cadena de la polimerasa

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Q

¿Qué se necesita para realizar una PCR?

A
  • Secuencia de DNA
  • Primers
  • DNA polimerasa
  • dNTPs
  • Buffer/Cofactor
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6
Q

Que polimerasa se usa

A

Taq polimerasa
Resiste temperaturas de 95 grados

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7
Q

Función de Taq

A

Polimeriza una cadena de DNA tomando como molde una preexistente

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8
Q

Características que deben tener los primers (5)

A

Son diseñados por el investigador, buscando que sea complementario a la secuencia buscada
Son cortos
Alto contenido en C y G
No debe ser autocomplementario
No debe formar estructuras secundarias

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9
Q

Es el fragmento de DNA que contiene el gen a buscar

A

DNA templete

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10
Q

Es lo que determina el inicio y el término de la región que se va a amplificar

A

Primers

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11
Q

Cuánto deben medir los primers?

A

De 18 a 24 nm

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12
Q

dNTPs

A

Desoxirribonucleótidos trifosfatados

Adenina, Timina, Citosina y Guanina

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13
Q

Es una solución amortiguadora necesaria para que la Taq polimerasa haga su función

A

Buffer / Cofactor

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14
Q

Amortiguador

A

Es un buffer para regular el PH a 8.4 y funcione Taq polimerasa (neutraliza)

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15
Q

Cofactor cloruro de magnesio

A

Cofactor de Taq la ayuda en su reacción

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16
Q

Primers de PCR

A

Diseñados en laboratorio
Proporcionan un extremo 3’ para que inicie la síntesis
Alto contenido de GC

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17
Q

Tipos de primers

A

Forward 5 a 3 ‘
Reverse 3 a 5’

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18
Q

¿Qué secuencias fortalecen los primers?

A

GC- guanina citosina
+ difícil que se separen

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19
Q

Fases de la PCR (3)

A

Desnaturalización
Hibridación
Extensión

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20
Q

Fase donde las cadenas de DNA son calentadas y separadas

A

Desnaturalización

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21
Q

Temperatura a la que se separan las hebras de DNA

A

95ºC

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22
Q

Tiempo que tardan las cadenas de DNA en separarse

A

20 - 30 segundos

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23
Q

Fase donde los primers se alinean al extremo 3´ del templado previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria

A

Hibridación

24
Q

Fórmula para estimar la temperatura melting o de hibridación

A

Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T)

25
Q

Fase en la que la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-primers y empieza a agregar dNTP´s complementarios para crear las cadenas completas de DNA

A

Extensión

26
Q

Dirección en la que es la extensión de las cadenas

A

5´ a 3´

27
Q

Temperatura óptima para la reacción de extensión

A

72ºC

28
Q

¿Cuántas veces se repiten las fases?

A

De 20 - 30 veces

29
Q

Nombre de los equipos donde se realiza la reacción

A

Termocicladores

30
Q

¿Cómo verificas que la reacción transcurrió eficientemente?

A

Debes visualizar los amplicones a través de una electroforesis en geles de agarosa

31
Q

Por cada ciclo se genera el _____ de hebras

A

Doble

32
Q

PCR en tiempo real

A

Al final de cada ciclo se obtiene la cantidad exacta de ADN de la muestra

33
Q

Electroforesis

A

Técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en base a su tamaño y carga eléctrica

34
Q

Cómo funciona una electroforesis?

A

genera campo eléctrico alrededor de un gel y separa moléculas de DNA por su tamaño.
Entre más pequeñas viajan más lejos

35
Q

De qué es el gel para la electroforesis?

A

agarosa

36
Q

De qué depende la preparación del gel de agarosa?

A

Entre más concentrado, más pequeños los poros –> fragmentos de DNA más cortos

37
Q

Qué se necesita para observar el resultado de una electroforesis?

A

teñir las muestras para verlas con un transiluminador ultravioleta

38
Q

Elementos para electroforesis

A

Camara de electroforesis
Gel de agarosa
Marcador de peso molecular
Transiluminador

39
Q

Función de cámara de electroforesis

A

Genera campo eléctrico alrededor de un gel con dos polos que se conectan a una fuente de energía

40
Q

Cómo funcionan los colorantes para la PCR tiempo real?

A

no específicos: tienen afinidad por dsDNA y dan señal fluorescente
específicos: sondas fluorescentes de oligonucleótidos

41
Q

Cómo se puede saber el tamaño de las muestras obtenidas por electroforesis

A

comparando con marcador de peso molecular
DNA/proteínas de tamaño conocido

42
Q

Gel de agarosa

A

Polisacárido extraído de algas marinas, separa fragmentos de ADN de 100 pb a 25 kb

pb= pares de base

43
Q

¿De qué depende el tamaño de los poros de la matriz de gel?

A

De la concentración de agarosa es inversamente proporcional al tamaño del poro

44
Q

¿Cómo se escoge la concentración de agarosa?

A

De acuerdo al tamaño del ácido nucleico que se va a analizar

45
Q

Marcador de peso molecular

A

Mezcla de moléculas de DNA o proteínas de tamaño conocido que permiten comparar el tamaño de las moléculas (ác nucleicos o proteínas) en las muestras sometidas a electroforesis

46
Q

Qué tipos de PCR existen?

A

punto final
múltiple
PCR-RFLP
PCR TR
PCR tiempo real

47
Q

Característica y aplicación de PCR estándar

A

Amplifica el segmento de ADN con partidores y su detección es mediante geles de agarosa
Detección cualitativa de un segmento de ADN (si está o no)

48
Q

Característica y aplicación de PCR múltiple

A

tiene primers para varias secuencias
Amplificación de 2 o más segmentos de ADN utilizando varios partidores en un sola reacción de amplificación.
Detección mediante geles de agarosa
Detecta cualitativamente varios segmentos de ADN
Ejemplo: hallar varias bacterias en una muestra de un paciente

49
Q

PCR-RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphisms)

A

PCR estándar pero con paso posterior con enzimas de restricción. Detecta poliformismos genéticos SNPs

50
Q

PCR -RT

A

transcriptasa reversa. De RNA a DNA
Reverse transcriptase
Síntesis de cADN a partir de ARN, mediante transcripción reversa y luego una PCR

51
Q

Función PCR-RT

A

Expresar genes y detectar virus de ARN

52
Q

qPCR o PCR tiempo real

A

observa el resultado de cada ciclo en una computadora. Cuantifica
PCR estándar donde se utilizan tinciones o sondas con fluoróforos para detectar fragmentos amplificados.

53
Q

Función de qPCR

A

Detección cualitativa de uno o varios segmentos de ADN.
Se cuantifica el ADN o ver expresión de genes (RT)
Carga viral de virus y bacterias, insulina, miRNAS

54
Q

En la qPCR los productos amplificados pueden detectarse en cada ciclo

A

Verdadero

55
Q

¿Cuál es el método más sensible (específica) para detectar y cuantificar ác. nucleicos?

A

PCR tiempo real

Detecta pequeña carga viral de un virus

56
Q

Cuantificación PCR absoluta

A

Conocer número exacto de copias amplificadas del blanco .
Concentración precisa de ácidos nucleicos en una muestra
Medir la carga viral o bacteriana de un tejido

57
Q

Cuantificación relativa en qPCR

A

Evalúa cambios en la expresión de genes en distintos estados fisiológicos
Cambios se basan en los niveles del RNAm del gen blanco comparados con un gen de referencia que no cambia
Tengo 10 miRNAs pero debo tener 20. Ver exceso o déficit

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