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Biomol > PCR > Flashcards

PCR Flashcards

1
Q

Para qué sirve la PCR

A

Para obtener grandes cantidades de ADN

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Q

Qué hace la PCR?

A

Sintetiza varias secuencias complementarias de DNA a partir de una secuencia molde

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3
Q

PCR

A

Reacción en cadena de la polimerasa

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4
Q

Reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de DNA

A

Reacción en cadena de la polimerasa

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Q

¿Qué se necesita para realizar una PCR?

A
  • Secuencia de DNA
  • Primers
  • DNA polimerasa
  • dNTPs
  • Buffer/Cofactor
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6
Q

Que polimerasa se usa

A

Taq polimerasa
Resiste temperaturas de 95 grados

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7
Q

Función de Taq

A

Polimeriza una cadena de DNA tomando como molde una preexistente

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8
Q

Características que deben tener los primers (5)

A

Son diseñados por el investigador, buscando que sea complementario a la secuencia buscada
Son cortos
Alto contenido en C y G
No debe ser autocomplementario
No debe formar estructuras secundarias

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9
Q

Es el fragmento de DNA que contiene el gen a buscar

A

DNA templete

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10
Q

Es lo que determina el inicio y el término de la región que se va a amplificar

A

Primers

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11
Q

Cuánto deben medir los primers?

A

De 18 a 24 nm

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12
Q

dNTPs

A

Desoxirribonucleótidos trifosfatados

Adenina, Timina, Citosina y Guanina

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13
Q

Es una solución amortiguadora necesaria para que la Taq polimerasa haga su función

A

Buffer / Cofactor

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14
Q

Amortiguador

A

Es un buffer para regular el PH a 8.4 y funcione Taq polimerasa (neutraliza)

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15
Q

Cofactor cloruro de magnesio

A

Cofactor de Taq la ayuda en su reacción

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16
Q

Primers de PCR

A

Diseñados en laboratorio
Proporcionan un extremo 3’ para que inicie la síntesis
Alto contenido de GC

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17
Q

Tipos de primers

A

Forward 5 a 3 ‘
Reverse 3 a 5’

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18
Q

¿Qué secuencias fortalecen los primers?

A

GC- guanina citosina
+ difícil que se separen

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19
Q

Fases de la PCR (3)

A

Desnaturalización
Hibridación
Extensión

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20
Q

Fase donde las cadenas de DNA son calentadas y separadas

A

Desnaturalización

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21
Q

Temperatura a la que se separan las hebras de DNA

A

95ºC

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22
Q

Tiempo que tardan las cadenas de DNA en separarse

A

20 - 30 segundos

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23
Q

Fase donde los primers se alinean al extremo 3´ del templado previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria

A

Hibridación

24
Q

Fórmula para estimar la temperatura melting o de hibridación

A

Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T)

25
Fase en la que la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-primers y empieza a agregar dNTP´s complementarios para crear las cadenas completas de DNA
Extensión
26
Dirección en la que es la extensión de las cadenas
5´ a 3´
27
Temperatura óptima para la reacción de extensión
72ºC
28
¿Cuántas veces se repiten las fases?
De 20 - 30 veces
29
Nombre de los equipos donde se realiza la reacción
Termocicladores
30
¿Cómo verificas que la reacción transcurrió eficientemente?
Debes visualizar los amplicones a través de una electroforesis en geles de agarosa
31
Por cada ciclo se genera el _____ de hebras
Doble
32
PCR en tiempo real
Al final de cada ciclo se obtiene la cantidad exacta de ADN de la muestra
33
Electroforesis
Técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en base a su tamaño y carga eléctrica
34
Cómo funciona una electroforesis?
genera campo eléctrico alrededor de un gel y separa moléculas de DNA por su tamaño. Entre más pequeñas viajan más lejos
35
De qué es el gel para la electroforesis?
agarosa
36
De qué depende la preparación del gel de agarosa?
Entre más concentrado, más pequeños los poros –> fragmentos de DNA más cortos
37
Qué se necesita para observar el resultado de una electroforesis?
teñir las muestras para verlas con un transiluminador ultravioleta
38
Elementos para electroforesis
Camara de electroforesis Gel de agarosa Marcador de peso molecular Transiluminador
39
Función de cámara de electroforesis
Genera campo eléctrico alrededor de un gel con dos polos que se conectan a una fuente de energía
40
Cómo funcionan los colorantes para la PCR tiempo real?
no específicos: tienen afinidad por dsDNA y dan señal fluorescente específicos: sondas fluorescentes de oligonucleótidos
41
Cómo se puede saber el tamaño de las muestras obtenidas por electroforesis
comparando con marcador de peso molecular DNA/proteínas de tamaño conocido
42
Gel de agarosa
Polisacárido extraído de algas marinas, separa fragmentos de ADN de 100 pb a 25 kb pb= pares de base
43
¿De qué depende el tamaño de los poros de la matriz de gel?
De la concentración de agarosa es inversamente proporcional al tamaño del poro
44
¿Cómo se escoge la concentración de agarosa?
De acuerdo al tamaño del ácido nucleico que se va a analizar
45
Marcador de peso molecular
Mezcla de moléculas de DNA o proteínas de tamaño conocido que permiten comparar el tamaño de las moléculas (ác nucleicos o proteínas) en las muestras sometidas a electroforesis
46
Qué tipos de PCR existen?
punto final múltiple PCR-RFLP PCR TR PCR tiempo real
47
Característica y aplicación de PCR estándar
Amplifica el segmento de ADN con partidores y su detección es mediante geles de agarosa Detección cualitativa de un segmento de ADN (si está o no)
48
Característica y aplicación de PCR múltiple
tiene primers para varias secuencias Amplificación de 2 o más segmentos de ADN utilizando varios partidores en un sola reacción de amplificación. Detección mediante geles de agarosa Detecta cualitativamente varios segmentos de ADN Ejemplo: hallar varias bacterias en una muestra de un paciente
49
PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
PCR estándar pero con paso posterior con enzimas de restricción. Detecta poliformismos genéticos SNPs
50
PCR -RT
transcriptasa reversa. De RNA a DNA Reverse transcriptase Síntesis de cADN a partir de ARN, mediante transcripción reversa y luego una PCR
51
Función PCR-RT
Expresar genes y detectar virus de ARN
52
qPCR o PCR tiempo real
observa el resultado de cada ciclo en una computadora. Cuantifica PCR estándar donde se utilizan tinciones o sondas con fluoróforos para detectar fragmentos amplificados.
53
Función de qPCR
Detección cualitativa de uno o varios segmentos de ADN. Se cuantifica el ADN o ver expresión de genes (RT) Carga viral de virus y bacterias, insulina, miRNAS
54
En la qPCR los productos amplificados pueden detectarse en cada ciclo
Verdadero
55
¿Cuál es el método más sensible (específica) para detectar y cuantificar ác. nucleicos?
PCR tiempo real Detecta pequeña carga viral de un virus
56
Cuantificación PCR absoluta
Conocer número exacto de copias amplificadas del blanco . Concentración precisa de ácidos nucleicos en una muestra Medir la carga viral o bacteriana de un tejido
57
Cuantificación relativa en qPCR
Evalúa cambios en la expresión de genes en distintos estados fisiológicos Cambios se basan en los niveles del RNAm del gen blanco comparados con un gen de referencia que no cambia Tengo 10 miRNAs pero debo tener 20. Ver exceso o déficit

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