Spettroscopia Flashcards
Su cosa si basano le tecniche spettroscopiche?
sull’interazione tra materia e radiazione elettromagnetica, che ha sia natura particellare (fotoni) che ondulatoria (campo elettrico e magnetico).
Qual è la relazione tra lunghezza d’onda, velocità della luce e frequenza?
La lunghezza d’onda (λ) è direttamente proporzionale alla velocità della luce nel vuoto (C) e inversamente proporzionale alla frequenza (v), secondo la formula:
λ = C/v
range di lunghezza d’onda della luce visibile e della luce UV?
Luce visibile: 400-700 nm
Luce UV: 200-400 nm
Quali sono le due principali classi di spettroscopia?
Ad Assorbimento – la radiazione attraversa il campione eccitando gli elettroni. L’assorbimento è misurato tramite trasmittanza.
Ad Emissione – gli elettroni eccitati tornano allo stato fondamentale, emettendo radiazione a una lunghezza d’onda diversa. È alla base della fluorimetria.
Che tipo di informazioni dà la spettroscopia?
Qualitative: identifica le sostanze in base alle lunghezze d’onda assorbite o emesse.
Quantitative: l’intensità del segnale è proporzionale alla concentrazione del composto.
Qual è il picco di assorbimento del DNA? e delle proteine?
260 per il DNA
280 per le Proteine
Qual è la formula della Legge di Lambert-Beer e cosa descrive?
A = c * l * ε
L’assorbanza (A) di una soluzione è direttamente proporzionale:
- Alla concentrazione della sostanza (c).
- Al cammino ottico della soluzione (l), solitamente 1 cm.
- Al coefficiente di estinzione molare (ε), costante per ogni molecola e solvente.
Quali sono le condizioni affinché la Legge di Lambert-Beer sia valida?
Il campione deve contenere molecole pure o un singolo analita in soluzione.
L’assorbanza deve essere ≤ 2 per mantenere la linearità e l’affidabilità delle misurazioni
Quali lunghezze d’onda copre lo spettrofotometro e quali lampade utilizza come sorgente luminosa?
Copre lunghezze d’onda da 220 a 750 nm.
Utilizza una lampada a Deuterio per la luce UV e una lampada a Tungsteno per la luce Visibile.
Componenti principali di uno spettrofotometro e la loro funzione?
Lampada - sorgente luminosa
Lente Collimatrice – concentra la luce.
Monocromatore – seleziona una certa lunghezza d’onda.
Cuvetta – con il campione.
Detector – rileva la luce trasmessa dal campione e digitalizza il segnale
Qual è il principio dei saggi colorimetrici qualitativi e come permettono di identificare una sostanza?
Si usano raggi Policromatici a spettro continuo che attraversano la sostanza e vengono assorbiti con diversa intensità, generando uno Spettro di Assorbimento.
Per identificare la sostanza, si confronta il grafico con campioni noti o banche dati, determinando il grado di purezza.
Come funzionano i saggi colorimetrici quantitativi e perché è necessaria una curva di calibrazione?
Usano raggi Monocromatici.
L’assorbimento è proporzionale alla concentrazione della sostanza.
Si usa una Curva di Calibrazione per minimizzare la variabilità analitica
Quando si effettuano i saggi end-point non enzimatici? Come funzionano?
Si effettuano quando l’analita è privo di caratteristiche spettroscopiche. Lo si fa reagire con un reagente, portando alla formazione di un prodotto colorato.
L’assorbanza del colore finale è proporzionale alla concentrazione dell’analita.
Perché nei saggi end-point non enzimatici si utilizza un reagente in eccesso?
Per garantire la completa conversione dell’analita
Fai un esempio di saggio end-point non enzimatico.
La determinazione di un campione contenente fosforo:
- si fa reagire con Ammonio Molibdato per formare Acido Fosfo-Molibdico
- si aggiunge Solfato Ferroso per ottenere Blu di Molibdato, che assorbe radiazioni a 600 nm.
Cos’è il Saggio di Bradford e a cosa serve?
È un saggio end-point non enzimatico utilizzato per determinare la concentrazione totale di proteine in un campione.
Quale reagente viene utilizzato nel Saggio di Bradford e come funziona
Il Reattivo di Bradford, che cambia colore da marrone chiaro (465 nm) ad azzurro (595 nm) quando lega le proteine.
Come si quantificano i risultati del Saggio di Bradford?
Per miscele proteiche - si costruisce una curva di calibrazione con soluzioni a concentrazione proteica nota.
Per molecole pure - si utilizza la Legge di Lambert-Beer
Cosa sono i saggi end-point enzimatici?
Analisi in cui una reazione enzimatica porta alla formazione di un prodotto colorato, la cui assorbanza è proporzionale alla concentrazione dell’analita.
Fai un esempio di saggio end-point enzimatico.
Il saggio del Glucosio:
- lo si fa reagisce con la Glucosio Ossidasi formando Acido Glucuronico e Perossido di Idrogeno.
- Il Perossido di Idrogeno, in presenza di Fenolo, Perossidasi e 4-Ammino-Antipirina, forma Chinonimina
- la concentrazione di Glucosio si ottiene confrontando l’assorbanza della Chinonimina con una curva di calibrazione
Cosa sono la turbidimetria e la nefelometria?
Analisi spettroscopiche.
Usano radiazioni mono o policromatiche per sospensioni di particelle stabili e prive di sedimentazioni, che deviano la radiazione incidente.
Cosa misura la turbidimetria e per cosa viene utilizzata?
misura l’assorbimento delle particelle maggiori di 1 micrometro. È usata per sospensioni di cellule batteriche o macrocomplessi, seguendo la legge di Lambert-Beer. è meno precisa ed usata per misurazioni rapide.
Quali sono le caratteristiche della nefelometria?
è più sensibile, precisa e accurata della turbidimetria.
è per particelle nell’ordine dei nanometri.
Misura la diffusione delle radiazioni (riflessione, rifrazione e diffrazione)
è usata per enzimi come amilasi e lipasi.
Cosa usa e cosa misura spettrofluorimetria ?
usa molecole fluorescenti e misura l’intensità della luce riemessa.
