Elettroforesi Flashcards
Cosa sono le tecniche elettroforetiche?
Sono tecniche che permettono di separare particelle cariche grazie alla migrazione in un campo elettrico, attraverso un mezzo liquido o solido. I cationi si spostano verso l’anodo e gli anioni verso il catodo. La velocità di migrazione dipende dalla forza del campo elettrico e dalle forze frizionali ed elettrostatiche del mezzo.
Quali materiali sono necessari per un’elettroforesi?
alimentatore a corrente continua
elettrodi
mezzi di separazione, ovvero:
gel
tamponi di corsa
Come funziona l’elettroforesi delle proteine?
È verticale e utilizza un gel di poliacrilammide. è più sottile dell’agarosio e la grandezza delle maglie è regolabile in base alle dimensioni delle molecole: per molecole piccole, il gel deve essere concentrato per avere maglie più strette.
Quali sono i due strati del gel nell’elettroforesi delle proteine?
Strato superiore – Stacking Gel (pH 6.8): compatta il campione per una corsa uniforme nel gel di separazione.
Strato inferiore – Gel di Separazione (pH 8.8): separa le molecole grazie alla differenza di pH, che crea un equilibrio tra proteine, ioni glicinato e cloro.
Come viene preparata la camera elettroforetica per l’elettroforesi delle proteine?
Il gel è posizionato su un supporto con una lastrina piccola interna per rilevare il flusso di corrente.
Si chiude il sistema si chiude con delle leve si inserisce nella camera elettroforetica.
Si posizionano gli elettrodi ai lati opposti
La camera può ospitare 2 gel contemporaneamente, o un surrogato di plastica, per chiudere il circuito.
Si versa il tampone di corsa (tris HCl) per garantire una migrazione uniforme.
Come vengono caricati i campioni nei pozzetti del gel? cosa si aggiunge?
Con un pipettatore. Si aggiunge:
- un colorante (Blu di Coomassie) per visualizzare la progressione
- glicerolo per appesantire il campione e mantenerlo nel pozzetto.
Accanto ai campioni si mette un riferimento detto Ladder, composto da molecole standard con pesi noti.
Come viene avviata la corsa elettroforetica?
La camera viene chiusa con un coperchio.
Gli elettrodi vengono collegati al generatore, impostato a 100 Volt.
Si avvia la corsa premendo il pulsante “Run”.
Cos’è la tecnica SDS-PAGE?
La SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) è un tipo di elettroforesi in condizioni denaturanti. Le proteine saranno tutte cariche negativamente, quindi la migrazione avviene solo in funzione del peso molecolare.
A cosa serve l’elettroforesi delle proteine plasmatiche? quali vengono identificate?
A separare le proteine plasmatiche formando un Pattern a bande identificabili con intensità proporzionale alla concentrazione (density plot).
Le bande corrispondono a: albumina più stretta, alfa1-, alfa2-, beta- e gamma-globuline, più larghe
Come si interpretano le alterazioni del protidogramma?
vanno valutate insieme a VES e PCR.
Quali sono le caratteristiche dell’elettroforesi degli acidi nucleici?
È di tipo orizzontale e solitamente nativa, ma può essere denaturante per RNA.
Come si prepara il gel per l’elettroforesi degli acidi nucleici?
Si usa uno stampo di plastica aperto ai lati con scotch, si cola agarosio liquido e si utilizza un pettine per creare i pozzetti. Una volta solidificato, si rimuovono scotch e pettine.
Il gel viene immerso nella camera elettroforetica tra i due elettrodi, con tampone TAE (Tris-Acetato-EDTA) e bromuro d’etidio per visualizzare i frammenti con fluorescenza.
A cosa servono i traccianti Xilene-Cianolo e Blu di Bromofenolo?
Servono per monitorare la migrazione dei campioni durante l’elettroforesi.
