Preparazione del Vetrino Flashcards
A che serve la Fissazione del Campione? Cosa si usa?
A conservarne la morfologia, bloccando i processi autolitici e proteggendolo dai microrganismi.
Si usano i Fissativi denaturano le proteine, rendendole insolubili e facendole precipitare in frammenti ultramicroscopici. Devono essere isotonici e mantenuti a pH 7.4 per evitare stress osmotici.
In base a cosa scegli un Fissativo?
Dimensione del campione
Tipo di costituenti chimici da conservare
Risoluzione della struttura da preservare
Quanto dura la fissazione di un campione?
In media, per un campione di 4 mm, 12-24 ore a temperatura ambiente. Ma dipende da:
-velocità di penetrazione del fissativo
-natura e spessore del campione.
Quali fissativi Coagulanti conosci?
o Etanolo (70-100%) – ha moderata penetrazione. Indurisce il materiale biologico. Annulla quasi totalmente l’attività enzimatica. fa precipitare le proteine e libera i lipidi legati ad esse. Spesso è miscelato con Formaldeide o Acido Acetico.
o Acido Acetico – ha ottima penetrazione. Non solubilizza i grassi, ma fa precipitare le Nucleo-proteine, altera i Mitocondri e causa il rigonfiamento del Collagene.
Fammi un esempio di Fissativo Non Coagulante
La formaldeide è un gas incolore, tossico e solubile in acqua (formalina) che:
Ha un’azione lenta ma elevata penetrazione
Non indurisce eccessivamente e non dissolve i lipidi
Si lega ai gruppi amminici delle proteine, mantenendone la solubilità
Aumenta l’acidità proteica, facilitando l’uso di coloranti basici
Qual è lo scopo del lavaggio del campione?
Con acqua corrente si rimuove l’eccesso di fissativo
In cosa consiste la disidratazione del tessuto?
nell’immersione progressiva in alcoli a concentrazione crescente per rimuovere l’acqua e permettere la penetrazione del mezzo di inclusione, che è apolare.
Quali sono le fasi dell’inclusione?
Infiltrazione - si immerge il tessuto disidratato nel Mezzo di Inclusione liquido per almeno 48 ore. Si può facilitare con una campana di vetro collegata ad una Pompa a Vuoto. Si porta la pressione fino a -800 mBar, poi si ritorna gradualmente alla pressione atmosferica
Indurimento o Polimerizzazione: Solidificazione del mezzo che permette di tagliare il tessuto in sezioni sottili
Quali Mezzi di Inclusione si utilizzano?
Paraffina - Miscela di cere insolubili in acqua ed etanolo. Si scioglie a 57-59° C e si filtra prima dell’uso. Infiltrazione minima è di 3 ore e permette sezioni di 1-2 µm.
Resine idrofile -Adatte a tessuti Decalcificati. I tempi di indurimento variano da 1 a 20 ore in base alla temperatura.
Resine Epossidiche - usate in microscopia elettronica per sezioni più sottili della paraffina. Garantisce un’eccellente conservazione strutturale, ma possono interagire con i tessuti.
Metacrilati - per ossa e denti. L’indurimento non è sempre uniforme e c’è il rischio di contrazione tissutale.
A che serve il Sezionamento?
A ridurre il campione in sezioni di 1–20 µm per essere penetrabili dalla luce e poter essere osservati al microscopio
Quale strumento viene utilizzato per sezionare i campioni?
Per la maggior parte dei campioni si utilizza un microtomo, mentre per i campioni in metacrilato, a causa della loro estrema durezza, si impiega una sega circolare a lama diamantata refrigerata ad acqua.
Come si evita la deformazione del campione durante il sezionamento?
accompagnandolo sul percorso della lama con un pennellino
In che modo le sezioni vengono raccolte e montate sui vetrini?
Sono raccolte con una pinzetta e fatte aderire a un vetrino mediante una goccia di acqua distillata, che favorisce l’espansione del mezzo di inclusione idrofilo.
Qual è lo scopo della colorazione nei campioni istologici?
Ad aumentare il contrasto tra le strutture cellulari, facilitandone il riconoscimento e l’analisi.
Qual è la differenza tra colorazione istologica e istochimica?
Istologica - per identificare la morfologica delle strutture cellulari.
Istochimica - per studiarne la composizione chimica.
Quali fattori influenzano l’efficacia della colorazione di un tessuto?
la permeabilità del tessuto
la sua affinità con il colorante
la quantità di colorante applicata.
Come si classificano i coloranti impiegati in istologia?
- Naturali: di origine animale o vegetale (es. ematossilina dal legno di campeggio);
- Sintetici, si suddividono in:
Acidi: legano molecole basiche, come le proteine citoplasmatiche (es. blu poirrolo);
Basici: legano molecole acide, come il DNA (es. blu di metilene).
Quali sono le diverse modalità di applicazione della colorazione?
Dirette: il tessuto assorbe direttamente il colorante;
Indirette: richiedono un mordente (es. ossidanti, allumi) che lega il colorante al tessuto;
Progressive: il colorante agisce fino a raggiungere l’intensità desiderata;
Regressive: si applica un eccesso di colorante che poi viene rimosso per ottenere un contrasto ottimale;
Combinate: si usano più coloranti in sequenza, ognuno dei quali si lega a strutture specifiche;
Semplici: impiegano un solo colorante e si suddividono ulteriormente in:
- Nucleari/Citoplasmatiche: in base alla struttura colorata;
- Monocromatiche: con un’unica tonalità;
- Metacromatiche: il colorante causa un viraggio del colore
Quali sono le fasi di chiusura del vetrino?
- Aggiunta di 1-2 gocce di Montante sul vetrino portaoggetti;
- Si posiziona il tessuto e lo si copre con il Vetrino Coprioggetti imbevuto di Xilene;
- Con una lieve pressione si distribuisce uniformemente il Montante
- Si fa asciugare a temperatura ambiente
