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S.3 Genho&Protheo > PCR y proteómica > Flashcards

PCR y proteómica Flashcards

1
Q

¿Qué es una PCR?

A
  • Reacción en cadena de polimerasa
  • Técnica de amplificación in vitro de una molécula de ADNgenómico
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2
Q

La longitud del fragmento que se quiere replicar estará delimitado por __________

A

Primers o cebadores u oligonucleótidos

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3
Q

Tipos de PCR

A
  • Convencional o punto final
  • Cualitativo
  • Semicuantitativo
  • Cuantitativo en tiempo real
  • Múltiple
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4
Q

PCR convencional o punto final

A
  • Amplificación de una región genética específica
  • Se analiza el producto amplificado mediante electroforesis en gel de agarosa o acrilamida.
  • Uso: Identificar presencia de secuencias específicas en muestras de ADN.
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5
Q

PCR cualitativo

A
  • Determina la presencia o ausencia de un fragmento de ADN específico. (SI o NO)
  • Dx de enf infecciosas al detectar genoma patógeno; para confirmación de mutaciones específicas
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6
Q

PCR semicuantitativo

A
  • Permite conocer los niveles de expresión de un gen (ARNm) (comparas expresión; cuánto hay)
  • Análisis de expresión génica en biopsias.
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7
Q

PCR cuantitativo (qPCR)
-> PCR cuantitativa en tiempo real, o qPCR

A
  • Mide la cantidad de microorganismos o ARNm de un gen en particular
  • Se utiliza una curva estándar con concentraciones conocidas como referencia.
    -> Se basa en la medición en tiempo real de la fluorescencia, ciertos genes se modifican con ciertos estímulos; ocupo curva de referencia para ir añadiendo de poco a poco (gen de insulina)
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8
Q

PCR múltiple

A
  • Amplificación de varias regiones genéticas en una misma reacción de PCR
  • Cada región cuenta con su propio par de oligos (primers)
    -> Detección simultánea de múltiples patógenos.
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9
Q

Principio básico utilizado en la amplificación en PCR

A

Complementariedad
Dirección 5’ -> 3’ (3’ tiene que estar libre para seguir añadiendo)

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10
Q

3 etapas de la amplificación

A
  • Desnaturalización
  • Replicación
  • Elongación
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11
Q

Componentes de la amplificación

A
  • ADN
  • Primers
  • ADN polimerasa
  • dNTPs (desoxinucleótidos): con grupo OH para que se siga extendiendo
  • Magnesio (cofactor) -> Pol lo ocupa para funcionar, permite incorporación de dNTPs
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12
Q

Características de los dNTPs

A

Desoxinucleótidos libres en forma trifosfatada (estabilidad); estos fosfatos ayudarán a formar el enlace fosfodiéster

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13
Q

Purinas y pirimidinas

A
  • Purinas: bn con un anillo doble de dos carbonos, y están formadas por la adenina (A) y la guanina (G).
  • Pirimidina: bn con un anillo simple de un carbono, y están formadas por la citosina (C), la timina (T) y el uracilo (U
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14
Q

Proceso PCR: Paso 1

A

Inicio de la desnaturalización
95°C, 5 minutos
Objetivo: Romper las uniones de hidrógeno entre las cadenas de ADN bicatenario, separándolas en dos cadenas simples.

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15
Q

Ciclos de amplificación: (Generalmente 35 ciclos)
Paso 2

A
  • Desnaturalización (↑ 95°C a 30s) -> Separar nuevamente las cadenas de ADN antes de cada paso de amplificación.
  • Alineamiento (50-60°C a 30-40s) -> Permitir que los primers se unan específicamente a las secuencias complementarias del ADN molde.
  • Extensión (72°C) -> La Taq polimerasa sintetiza una nueva cadena complementaria de ADN a partir de los primers.
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16
Q

Amplificación final Paso 3

A

Temperatura: 72 °C.
Objetivo: Asegurar que todos los productos de ADN se hayan completado en su totalidad.

pa que Pol llene nt que le faltaron

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17
Q

Almacenamiento temporal Paso 4

A

Temperatura: 4 °C.
Objetivo: Mantener el ADN amplificado en condiciones estables para su posterior análisis.

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18
Q

Se observa un ciclo de PCR que incluye
brevemente

A
  • Separación de cadenas (desnaturalización).
  • Unión de primers (alineamiento).
  • Extensión por la polimerasa (elongación).
    -> Al final de 35 ciclos, se obtienen miles o millones de copias de la región específica de ADN.
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19
Q

PCR en tiempo real (qPCR) Origen

A
  • Higuchi et al. (1992): Describieron una modificación de la técnica de PCR convencional,
  • Se adaptó para realizar un análisis simultáneo de varias secuencias -> PCR en tiempo real o cuantitativa
  • Se observa en tiempo real el crecimiento de la curva de amplificación, e identificar la fluorescencia conforme avanza la reacción
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20
Q

Métodos de detección de PCR en tiempo real

A

Detección mediante fluorescencia
→ SYBR
→ TaqMan

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21
Q

Características de SYBR

A
  • Intercalante de DNA (bromuro de etidio)
  • Se une al ADN de doble cadena durante la polimerización, y se inserta, se detecta y va a fluorescer; se va intercalando distintas moléculas de SYBER entre distintas hebras de doble cadena, pasa láser que excita.
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22
Q

Aplicaciones SYBER

A
  • Ideal para estudios de expresión génica, ya que no requiere sondas específicas.
  • Se utiliza cuando el objetivo es analizar ADN de doble cadena en general, sin discriminar variantes específicas.
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23
Q

Características de TaqMan

A
  • Se utiliza para identificar SNPs (polimorfismos)
  • Usa sonda específica: Un fluoróforo que emite la señal.
  • Un quencher (apagador) que inhibe la fluorescencia hasta que la sonda se descompone.
    -> Durante la polimerización, la enzima Taq pol (se une al primer) corta la sonda, separando el fluoróforo del quencher y generando fluorescencia.
    -> según el color que de, el nt que sea, estas sondas son específicas de SNPs (c/u con secuencia específica)
24
Q

Aplicaciones de TaqMan

A

Identificación de SNPs y diferenciación de alelos específicos; nos permite genotipificar
-> sondas tienen 3 fluoróforos o reporteros (VIC y FAM)

25
Q

¿Qué es la discriminación alélica?

A
  • Es un análisis que identifica genotipos específicos en una muestra mediante la diferenciación de alelos (variante silvestre, mutante o heterocigoto).
  • Se basa en la detección de fluorescencia emitida por sondas específicas para cada alelo
26
Q

PCR en tiempo real; el análisis permite _____

A

identificar la fluorescencia conforme avanza la reacción; es exponencial, en los ciclos 13-15 empieza fluorescencia

27
Q

Ventajas de la PCR tiempo real (3)

A
  • Permite medir la eficiencia de la reacción
  • A diferencia de la PCR convencional, la qPCR no necesita correr geles de agarosa para verificar los productos amplificados. (es mediante fluorescencia)
  • Más rápido y eficiente en comparación con la PCR de punto final (convencional).
    -> a su vez > precisión y sensibilidad, menor riesgo de contaminación cruzada
28
Q

Aplicaciones de la PCR en tiempo real

A
  • Análisis de expresión (cáncer)
  • Investigación -> detección de polimorfismo asociado a enf
  • Estudios de asociación caso-control: Comparación entre individuos sanos y enf para identificar cambios genéticos relacionados con la enf
  • Dx de enfermedades: detectar presencia de virus en muestras clínicas (COVID)
29
Q

Proyecto encargado de descubrir los elementos funcionales de la secuencia

A

ENCODE
Genoma humano -> da inf acerca de las variaciones del genoma

30
Q

Proceso que permite que 22,000 genes podrían originar en una sola célula 500,000 proteínas diferentes

A

Splicing alternativo

31
Q

Las modificaciones post-traduccionales sirven para _________

A

regular la actividad, estabilidad, localización subcelular de una proteína; así como sus interacciones con otras proteínas
-> prot efectoras del trabajo celular
-> ocupamos que cofactor esté bien, no nos basta unión prot-prot

32
Q

Proteómica objetivo

A

Es entender la expresión, función y regulación del conjunto completo de proteínas codificadas por un organismo
-> permitirá comprender procesos biológicos y su variación en la enf vs estado de salud ya que se evalúa interacción entre prot, modif post-trad, funciones y localización

33
Q

Ciencia que nos ayuda a evaluar un análisis sistémico de las proteínas

A

Proteómica

34
Q

Técnicas para realizar estudios de las proteínas

A
  • Electroforesis mono y bidimensional
  • Espectrometría de masas (secuenciar prot)
  • Técnicas in silico (análisis de bases de datos)
35
Q

Caract de la proteómica (2 de chill)

A
  • Requiere fraccionar mezclas de prot o péptidos para su análisis
  • Estrategias para la separación buscan reducir la complejidad y el tiempo de análisis
36
Q

¿Cómo se aísla una proteína?

A

La proteína de estudio se aísla por la afinidad que tiene con un anticuerpo y las proteínas que están pegadas a ellas se analizan por espectrometría de masas. (MS)

37
Q

Las interacciones proteína-proteína se analizan mediante la purificación por _______

A

Afinidad-MS

38
Q

El proceso de purificación de una proteína supone una secuencia de etapas en las que las proteínas contaminantes se eliminan a partir de _______

A

Diferencias de tamaño, carga e hidrofobicidad.

39
Q

La purificación se monitoriza mediante ____

A

SDS-PAGE (gel bidimensional)
- SDS: Detergente que desnaturaliza las proteínas y las carga negativamente.
- PAGE: Gel de poliacrilamida, que actúa como matriz para separar las proteínas.

40
Q

Pasos para el análisis de estructura proteica

A

1- Extracción/Homogenización
2- Desalinización/diálisis y concentración: remueve sales o contaminantes pequeños
3- Intercambio iónico y cromatografía de filtración en gel: para separar proteínas según tamaño y carga
4- SDS-PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida): permite separar proteínas en función de su peso molecular bajo condiciones desnaturalizantes.
5- Degradación proteolítica: para facilitar su análisis
6- Purificación y secuenciación de péptidos

41
Q

O´ Farrel desarrollaron la técnica de separación de prot utilizando geles de poliacrilamida dos dimensiones:

A

1- Isoelectroenfoque (IEE): proteínas se separan según su punto isoeléctrico (PI)
2- Las proteínas separadas según su PI se colocan en un SDS-PAGE y se separan según su peso molecular.
-> prot más pequeñas migran más hacia la parte inferior del gel debido a la menor resistencia.
-> primero por carga y luego por tamaño

42
Q

Electroforesis bidimensional (2D-PAGE), una técnica avanzada para separar proteínas basándose en dos propiedades
y qué es?

A

punto isoeléctrico (PI) y masa molecular
-> El PI es el pH en el cual una proteína tiene carga neta neutra y deja de migrar en un gradiente de pH.

43
Q

Una vez se separan las proteínas según su punto isoeléctrico (pI) y su masa molecular mediante electroforesis bidimensional (2D-PAGE). (corrida de gel bidemensional)
¿Qué sigue?

A

Las manchas individuales en el gel se visualizan mediante técnicas de tinción, como:
Tinción de plata.
Tinción con azul de Coomassie.
Esto permite identificar visualmente las proteínas separadas.

44
Q

¿Qué sigue después de aplicar la tinción?

A
  • Cada mancha individual se digiera con proteasas, como la tripsina.
  • Este paso rompe las proteínas en fragmentos más pequeños (péptidos), facilitando su análisis posterior.
45
Q

Después de la digestión enzimática ¿Qué sigue?

A
  • Los fragmentos de péptidos generados se analizan por espectrometría de masas, que mide la masa y carga de los péptidos.
  • con esta info; se compara con bases de datos proteómicas para identificar la proteína original -> debido a que cada A.A tiene una masa molecular específica
46
Q

Uso de la espectrometría de masas (MS)

A
  • Digestión de muestras proteicas (tripsina); lo que genera péptidos más pequeños
  • Cada péptido tiene una combinación única de A.A que determina su masa molecular específica.
  • Se llama huella dactilar debido a que hay péptidos específicos en las prot
47
Q

Mide con precisión las masas de los péptidos generados.

A

La espectrometría de masas

48
Q

Caract de MS

A
  • Los fragmentos de prot analizados son comparados con las bases de datos genómicos y así poder inferir las prot
  • Esto a través de un ensayo in silico (en compu)
  • Las caract. únicas de cada A.A nos permitirán identificar la prot
    Secuenciar prot = MS
49
Q

¿A qué se refiere la huella peptídica?

A
  • Capacidad de identificar una prot, debido a que cada A.A tiene caract diferentes
  • Técnica mediante la cual es posible la identificación de prot
  • Utiliza MS -> esta usa la relación masa/carga para calcular los componentes que forman una prot
50
Q

MALDI-TOF

A

Desorción/Ionización Láser Asistido por Matriz Acoplado a Tiempo de Vuelo (MALDI-TOF).
-> (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight):

51
Q

Principio
MALDI-TOF

A

Es una tecnología asistida por matriz.
Requiere que el analito esté co-cristalizado con la matriz.

52
Q

Proceso
MALDI-TOF

A
  • Desorción: Se irradia una placa con el analito y la matriz usando un láser (337 nm), lo que expulsa al analito y a partes de la matriz en forma gaseosa. (se le añaden iones para mantenerla intacta)
  • Ionización: Las moléculas de la matriz transfieren protones al analito, ionizando la muestra.
  • Desolvatación: Los residuos de la matriz se eliminan en este paso, dejando al analito estabilizado en forma gaseosa. Se eliminan protones tras estabilizar la muestra.
53
Q

en la forma gaseosa ¿Qué ocurre?
Maldi

A

En la fase gaseosa, se añaden iones para mantener la integridad de la muestra.
Se eliminan protones tras estabilizar la muestra.

54
Q

Tiempo de vuelo (TOF):

A

Las moléculas son aceleradas por un campo eléctrico.
La velocidad de cada molécula depende de su relación masa/carga (m/z).

55
Q

Principio de medición:
TOF

A

Se mide el tiempo que tardan las moléculas en llegar al detector dentro del analizador.
Permite diferenciar moléculas por su masa y carga.
-> alta capacidad de procesamiento (96)

56
Q

Usos
MALDI-TOF

A

Identificación de cepas bacterianas y fúngicas mediante las variantes de masa carga
Diagnóstico clínico
-> permite diferenciar entre cepas fúngicas o MO de prot diferentes
-> para identificar distintas especies de SARS-COV por ej

57
Q

Cada molécula tiene ____
MALDI-TOF

A

una velocidad específica según su masa.
Las relaciones masa/carga cambian dependiendo de la composición del analito.

S.3 Genho&Protheo (18 decks)

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