PCR y proteómica Flashcards
¿Qué es una PCR?
- Reacción en cadena de polimerasa
- Técnica de amplificación in vitro de una molécula de ADNgenómico
La longitud del fragmento que se quiere replicar estará delimitado por __________
Primers o cebadores u oligonucleótidos
Tipos de PCR
- Convencional o punto final
- Cualitativo
- Semicuantitativo
- Cuantitativo en tiempo real
- Múltiple
PCR convencional o punto final
- Amplificación de una región genética específica
- Se analiza el producto amplificado mediante electroforesis en gel de agarosa o acrilamida.
- Uso: Identificar presencia de secuencias específicas en muestras de ADN.
PCR cualitativo
- Determina la presencia o ausencia de un fragmento de ADN específico. (SI o NO)
- Dx de enf infecciosas al detectar genoma patógeno; para confirmación de mutaciones específicas
PCR semicuantitativo
- Permite conocer los niveles de expresión de un gen (ARNm) (comparas expresión; cuánto hay)
- Análisis de expresión génica en biopsias.
PCR cuantitativo (qPCR)
-> PCR cuantitativa en tiempo real, o qPCR
- Mide la cantidad de microorganismos o ARNm de un gen en particular
- Se utiliza una curva estándar con concentraciones conocidas como referencia.
-> Se basa en la medición en tiempo real de la fluorescencia, ciertos genes se modifican con ciertos estímulos; ocupo curva de referencia para ir añadiendo de poco a poco (gen de insulina)
PCR múltiple
- Amplificación de varias regiones genéticas en una misma reacción de PCR
- Cada región cuenta con su propio par de oligos (primers)
-> Detección simultánea de múltiples patógenos.
Principio básico utilizado en la amplificación en PCR
Complementariedad
Dirección 5’ -> 3’ (3’ tiene que estar libre para seguir añadiendo)
3 etapas de la amplificación
- Desnaturalización
- Replicación
- Elongación
Componentes de la amplificación
- ADN
- Primers
- ADN polimerasa
- dNTPs (desoxinucleótidos): con grupo OH para que se siga extendiendo
- Magnesio (cofactor) -> Pol lo ocupa para funcionar, permite incorporación de dNTPs
Características de los dNTPs
Desoxinucleótidos libres en forma trifosfatada (estabilidad); estos fosfatos ayudarán a formar el enlace fosfodiéster
Purinas y pirimidinas
- Purinas: bn con un anillo doble de dos carbonos, y están formadas por la adenina (A) y la guanina (G).
- Pirimidina: bn con un anillo simple de un carbono, y están formadas por la citosina (C), la timina (T) y el uracilo (U
Proceso PCR: Paso 1
Inicio de la desnaturalización
95°C, 5 minutos
Objetivo: Romper las uniones de hidrógeno entre las cadenas de ADN bicatenario, separándolas en dos cadenas simples.
Ciclos de amplificación: (Generalmente 35 ciclos)
Paso 2
- Desnaturalización (↑ 95°C a 30s) -> Separar nuevamente las cadenas de ADN antes de cada paso de amplificación.
- Alineamiento (50-60°C a 30-40s) -> Permitir que los primers se unan específicamente a las secuencias complementarias del ADN molde.
- Extensión (72°C) -> La Taq polimerasa sintetiza una nueva cadena complementaria de ADN a partir de los primers.
Amplificación final Paso 3
Temperatura: 72 °C.
Objetivo: Asegurar que todos los productos de ADN se hayan completado en su totalidad.
pa que Pol llene nt que le faltaron
Almacenamiento temporal Paso 4
Temperatura: 4 °C.
Objetivo: Mantener el ADN amplificado en condiciones estables para su posterior análisis.
Se observa un ciclo de PCR que incluye
brevemente
- Separación de cadenas (desnaturalización).
- Unión de primers (alineamiento).
- Extensión por la polimerasa (elongación).
-> Al final de 35 ciclos, se obtienen miles o millones de copias de la región específica de ADN.
PCR en tiempo real (qPCR) Origen
- Higuchi et al. (1992): Describieron una modificación de la técnica de PCR convencional,
- Se adaptó para realizar un análisis simultáneo de varias secuencias -> PCR en tiempo real o cuantitativa
- Se observa en tiempo real el crecimiento de la curva de amplificación, e identificar la fluorescencia conforme avanza la reacción
Métodos de detección de PCR en tiempo real
Detección mediante fluorescencia
→ SYBR
→ TaqMan
Características de SYBR
- Intercalante de DNA (bromuro de etidio)
- Se une al ADN de doble cadena durante la polimerización, y se inserta, se detecta y va a fluorescer; se va intercalando distintas moléculas de SYBER entre distintas hebras de doble cadena, pasa láser que excita.
Aplicaciones SYBER
- Ideal para estudios de expresión génica, ya que no requiere sondas específicas.
- Se utiliza cuando el objetivo es analizar ADN de doble cadena en general, sin discriminar variantes específicas.
Características de TaqMan
- Se utiliza para identificar SNPs (polimorfismos)
- Usa sonda específica: Un fluoróforo que emite la señal.
- Un quencher (apagador) que inhibe la fluorescencia hasta que la sonda se descompone.
-> Durante la polimerización, la enzima Taq pol (se une al primer) corta la sonda, separando el fluoróforo del quencher y generando fluorescencia.
-> según el color que de, el nt que sea, estas sondas son específicas de SNPs (c/u con secuencia específica)
Aplicaciones de TaqMan
Identificación de SNPs y diferenciación de alelos específicos; nos permite genotipificar
-> sondas tienen 3 fluoróforos o reporteros (VIC y FAM)
¿Qué es la discriminación alélica?
- Es un análisis que identifica genotipos específicos en una muestra mediante la diferenciación de alelos (variante silvestre, mutante o heterocigoto).
- Se basa en la detección de fluorescencia emitida por sondas específicas para cada alelo
PCR en tiempo real; el análisis permite _____
identificar la fluorescencia conforme avanza la reacción; es exponencial, en los ciclos 13-15 empieza fluorescencia
Ventajas de la PCR tiempo real (3)
- Permite medir la eficiencia de la reacción
- A diferencia de la PCR convencional, la qPCR no necesita correr geles de agarosa para verificar los productos amplificados. (es mediante fluorescencia)
- Más rápido y eficiente en comparación con la PCR de punto final (convencional).
-> a su vez > precisión y sensibilidad, menor riesgo de contaminación cruzada
Aplicaciones de la PCR en tiempo real
- Análisis de expresión (cáncer)
- Investigación -> detección de polimorfismo asociado a enf
- Estudios de asociación caso-control: Comparación entre individuos sanos y enf para identificar cambios genéticos relacionados con la enf
- Dx de enfermedades: detectar presencia de virus en muestras clínicas (COVID)
Proyecto encargado de descubrir los elementos funcionales de la secuencia
ENCODE
Genoma humano -> da inf acerca de las variaciones del genoma
Proceso que permite que 22,000 genes podrían originar en una sola célula 500,000 proteínas diferentes
Splicing alternativo
Las modificaciones post-traduccionales sirven para _________
regular la actividad, estabilidad, localización subcelular de una proteína; así como sus interacciones con otras proteínas
-> prot efectoras del trabajo celular
-> ocupamos que cofactor esté bien, no nos basta unión prot-prot
Proteómica objetivo
Es entender la expresión, función y regulación del conjunto completo de proteínas codificadas por un organismo
-> permitirá comprender procesos biológicos y su variación en la enf vs estado de salud ya que se evalúa interacción entre prot, modif post-trad, funciones y localización
Ciencia que nos ayuda a evaluar un análisis sistémico de las proteínas
Proteómica
Técnicas para realizar estudios de las proteínas
- Electroforesis mono y bidimensional
- Espectrometría de masas (secuenciar prot)
- Técnicas in silico (análisis de bases de datos)
Caract de la proteómica (2 de chill)
- Requiere fraccionar mezclas de prot o péptidos para su análisis
- Estrategias para la separación buscan reducir la complejidad y el tiempo de análisis
¿Cómo se aísla una proteína?
La proteína de estudio se aísla por la afinidad que tiene con un anticuerpo y las proteínas que están pegadas a ellas se analizan por espectrometría de masas. (MS)
Las interacciones proteína-proteína se analizan mediante la purificación por _______
Afinidad-MS
El proceso de purificación de una proteína supone una secuencia de etapas en las que las proteínas contaminantes se eliminan a partir de _______
Diferencias de tamaño, carga e hidrofobicidad.
La purificación se monitoriza mediante ____
SDS-PAGE (gel bidimensional)
- SDS: Detergente que desnaturaliza las proteínas y las carga negativamente.
- PAGE: Gel de poliacrilamida, que actúa como matriz para separar las proteínas.
Pasos para el análisis de estructura proteica
1- Extracción/Homogenización
2- Desalinización/diálisis y concentración: remueve sales o contaminantes pequeños
3- Intercambio iónico y cromatografía de filtración en gel: para separar proteínas según tamaño y carga
4- SDS-PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida): permite separar proteínas en función de su peso molecular bajo condiciones desnaturalizantes.
5- Degradación proteolítica: para facilitar su análisis
6- Purificación y secuenciación de péptidos
O´ Farrel desarrollaron la técnica de separación de prot utilizando geles de poliacrilamida dos dimensiones:
1- Isoelectroenfoque (IEE): proteínas se separan según su punto isoeléctrico (PI)
2- Las proteínas separadas según su PI se colocan en un SDS-PAGE y se separan según su peso molecular.
-> prot más pequeñas migran más hacia la parte inferior del gel debido a la menor resistencia.
-> primero por carga y luego por tamaño
Electroforesis bidimensional (2D-PAGE), una técnica avanzada para separar proteínas basándose en dos propiedades
y qué es?
punto isoeléctrico (PI) y masa molecular
-> El PI es el pH en el cual una proteína tiene carga neta neutra y deja de migrar en un gradiente de pH.
Una vez se separan las proteínas según su punto isoeléctrico (pI) y su masa molecular mediante electroforesis bidimensional (2D-PAGE). (corrida de gel bidemensional)
¿Qué sigue?
Las manchas individuales en el gel se visualizan mediante técnicas de tinción, como:
Tinción de plata.
Tinción con azul de Coomassie.
Esto permite identificar visualmente las proteínas separadas.
¿Qué sigue después de aplicar la tinción?
- Cada mancha individual se digiera con proteasas, como la tripsina.
- Este paso rompe las proteínas en fragmentos más pequeños (péptidos), facilitando su análisis posterior.
Después de la digestión enzimática ¿Qué sigue?
- Los fragmentos de péptidos generados se analizan por espectrometría de masas, que mide la masa y carga de los péptidos.
- con esta info; se compara con bases de datos proteómicas para identificar la proteína original -> debido a que cada A.A tiene una masa molecular específica
Uso de la espectrometría de masas (MS)
- Digestión de muestras proteicas (tripsina); lo que genera péptidos más pequeños
- Cada péptido tiene una combinación única de A.A que determina su masa molecular específica.
- Se llama huella dactilar debido a que hay péptidos específicos en las prot
Mide con precisión las masas de los péptidos generados.
La espectrometría de masas
Caract de MS
- Los fragmentos de prot analizados son comparados con las bases de datos genómicos y así poder inferir las prot
- Esto a través de un ensayo in silico (en compu)
- Las caract. únicas de cada A.A nos permitirán identificar la prot
Secuenciar prot = MS
¿A qué se refiere la huella peptídica?
- Capacidad de identificar una prot, debido a que cada A.A tiene caract diferentes
- Técnica mediante la cual es posible la identificación de prot
- Utiliza MS -> esta usa la relación masa/carga para calcular los componentes que forman una prot
MALDI-TOF
Desorción/Ionización Láser Asistido por Matriz Acoplado a Tiempo de Vuelo (MALDI-TOF).
-> (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight):
Principio
MALDI-TOF
Es una tecnología asistida por matriz.
Requiere que el analito esté co-cristalizado con la matriz.
Proceso
MALDI-TOF
- Desorción: Se irradia una placa con el analito y la matriz usando un láser (337 nm), lo que expulsa al analito y a partes de la matriz en forma gaseosa. (se le añaden iones para mantenerla intacta)
- Ionización: Las moléculas de la matriz transfieren protones al analito, ionizando la muestra.
- Desolvatación: Los residuos de la matriz se eliminan en este paso, dejando al analito estabilizado en forma gaseosa. Se eliminan protones tras estabilizar la muestra.
en la forma gaseosa ¿Qué ocurre?
Maldi
En la fase gaseosa, se añaden iones para mantener la integridad de la muestra.
Se eliminan protones tras estabilizar la muestra.
Tiempo de vuelo (TOF):
Las moléculas son aceleradas por un campo eléctrico.
La velocidad de cada molécula depende de su relación masa/carga (m/z).
Principio de medición:
TOF
Se mide el tiempo que tardan las moléculas en llegar al detector dentro del analizador.
Permite diferenciar moléculas por su masa y carga.
-> alta capacidad de procesamiento (96)
Usos
MALDI-TOF
Identificación de cepas bacterianas y fúngicas mediante las variantes de masa carga
Diagnóstico clínico
-> permite diferenciar entre cepas fúngicas o MO de prot diferentes
-> para identificar distintas especies de SARS-COV por ej
Cada molécula tiene ____
MALDI-TOF
una velocidad específica según su masa.
Las relaciones masa/carga cambian dependiendo de la composición del analito.
