Microarreglos y más Flashcards
Bases de datos públicas secuencias genómicas
- Mapviewer, del NCBI: ClinVar, Pubmed, Gene, dbSNP
- Ensembl: mantienen conjuntamente el Wellcome Trust Sanger Institute -> buscas gen, rs, enf relacionado
- Uni of California Sta. Cruz -> base de datos con datos genómicos
Bases de datos de vías metabólicas
KEGG
Reactome
-> estas permiten entender en detalle enfermedades que afecten a alguna de estas rutas; y proponer posible vías de intervención terapéutica
Repositorio central de datos gratuito sobre proteínas
UniProt (Universal Protein)
Ensembl
Frecuencia de polimorfismos en distintas regiones o poblaciones
Polyphen
Predice efecto de una sustitución de A.A en estructura y función
Define muestra biológica
Muestra de material como orina, sangre, tejido, cx, DNA, RNA o proteínas de seres humanos, plantas o animales
Ejemplos de obtención de muestras biológicas
Extracción de sangre, biopsia, frotis, hisopado, punción lumbar
Importancia de las muestras biológicas
- Son esenciales para el dx y monitorización de enf
- Investigación
- Creación de bancos de datos genéticos
Finalidad del análisis de fluidos corporales:
permiten determinar el estado biológico y bioquímico de un individuo.
Los fluidos corporales permiten evaluar
- Inflamación.
- Presencia o ausencia de infecciones.
- Naturaleza de tumores (malignos o benignos).
Tipos de fluidos corporales que se analizan:
- Líquido sinovial, cefalorraquídeo, de membranas serosas y de líquido amniótico.
- Orina.
- Heces -> por la microbiota
- Semen.
- Secreciones vaginales.
Análisis en fluidos corporales:
Incluye aspectos como
Volumen.
Apariencia.
Color.
Conteo celular, entre otros.
-> Extracción de ácidos nucleicos (DNA, RNA): ac muy inestables, necesario almacenarlos bajo condiciones de congelación para su preservación.
Tipos de muestras utilizadas para extracción de DNA:
Sangre periférica (leucocitos).
Células epiteliales bucales.
Raíces de cabello.
Biopsia de tejido.
Líquido amniótico (diagnóstico prenatal):
Usado para evaluar el riesgo de enfermedades congénitas.
Tejido o células en cultivo.
Huesos largos -> para la MO
Definición de microarreglos:
Metodología que permite la identificación de moléculas de ADN o ARN mediante hibridación en una estructura de vidrio o silicona
Mecanismo de acción de los microarreglos
Se basa en la hibridación de bases complementarias (de dos o más bases).
-> Las moléculas hibridadas son detectadas mediante marcas de fluorescencia
Fundamento de la técnica
Microarreglos
- Hibridación de ácidos nucleicos (DNA o RNA): Basada en el principio de complementariedad de bases.
- Detección por fluorescencia: Utiliza bases nucleotídicas (BN) marcadas
- Se obtiene una señal fluorescente en dónde haya hibridación
- Permite analizar miles de variantes genéticas en un solo ensayo
¿Qué es la hibridación?
Proceso que consiste en la unión de dos moléculas complementarias de ADN o ARN para formar una molécula de doble cadena.
Microarreglos de DNA
Identificar variaciones genéticas (SNPs, deleciones, duplicaciones).
-> usado para estudio de polimorfismos;
-> con alta estabilidad
Microarreglos de RNA
- El oligo(dT) actúa como un primer que se une específicamente a la poli-A del mRNA para sintetizar el cDNA a partir de una RT
- El cDNA generado no contiene intrones ni regiones UTR, lo que facilita su análisis.
Tipos de microarreglo (4)
- ADN: Detectan variantes genéticas específicas, como los SNPs
- ARN: Para el análisis de expresión génica.
Debido a la inestabilidad del RNA, se analiza en forma de cDNA - Metilación: Permiten el análisis y comparación de sitios de metilación en el ADN; CpG (islas CpG)
- Proteínas: Analizan proteínas mediante la utilización de anticuerpos específicos
Estructura de los microarreglos:
Los oligonucleótidos (de 15 a 25 nucleótidos) se sintetizan en el laboratorio y se distribuyen de manera ordenada sobre una estructura de silice o silicona (portaobjetos).
Propiedades de los oligonucleótidos:
- Cada oligonucleótido contiene miles de copias en una ubicación específica del microarreglo.
- Se agregan fragmentos de DNA derivados de librerías/genotecas (DNA marcado).
- Las variantes genéticas o secuencias se analizan de manera simultánea.
Cómo será la detección de los microarreglos
Los resultados se reflejan por medio de fluorescencia, que permite identificar las secuencias hibridadas.
-> a mayor fluorescencia, más cantidad de cDNA
Librerías de DNA
Microarreglos
Son colecciones de clonas de DNA, generadas a partir del material genómico de células nucleadas, como leucocitos mediante extracción de DNA
¿Qué se realiza para tener sitios de corte específicos en el ADN y qué generará?
- Se realiza una digestión controlada con enzimas de restricción que cortan en sitios específicos de la secuencia de DNA.
- El corte genera fragmentos de dif tamaños, que se pueden solapar para asegurar una cobertura completa y realizar un control de calidad.
-> modifico concentración y tiempo (a menor, se reduce el # de cortes)
Los fragmentos de DNA obtenidos se ______
unen a vectores y se clonan en bacterias o levaduras para generar una librería genómica completa.
Microarreglos de ADN (SNPs CHIP)
- Están diseñados específicamente para identificar un polimorfismo (SNP) específico en cada celda del chip.
- Actualmente, existen chips capaces de analizar hasta 50,000 variantes.
analizarías 50 SNPs así alv
no me conviene analizar los 50 SNPs, agarro uno o tres, TagSNPs el representante del bloque
Estructura del microarreglo:
Cada celda contiene un oligonucleótido específico diseñado para cada SNP
-> Cada variante genética (por ejemplo, alelos del SNP) está marcada con un fluoróforo diferente, permitiendo diferenciar entre los alelos presentes.
Microarreglos de ADN (SNPs CHIP) detectan diferentes genotipos mediante señales de fluorescencia
CELDA VERDE
- Homocigoto silvestre (C/C): Este genotipo indica que el individuo tiene dos copias del alelo “normal” o no mutado (alelo silvestre) para un SNP específico.
- Señal alta en verde: Esto indica que las sondas diseñadas para detectar el alelo “C” han hibridado exitosamente.
Microarreglos de ADN (SNPs CHIP) detectan diferentes genotipos mediante señales de fluorescencia
CELDA AMARILLA
- Heterocigoto (G/A): Este genotipo indica que el individuo tiene una copia del alelo “normal” (G) y una del alelo “mutado” (A).
- Ambas sondas, las diseñadas para “G” y las para “A”, han hibridado con sus respectivas secuencias complementarias en la muestra.
- La presencia de señales iguales en ambos colores indica que el individuo es heterocigoto, portador de ambos alelos (G/A).
Microarreglos de ADN (SNPs CHIP) detectan diferentes genotipos mediante señales de fluorescencia
CELDA ROJA
- Homocigoto mutante (T/T): Este genotipo indica que el individuo tiene dos copias del alelo “mutado” o variante específica del SNP (T).
- Señal alta en rojo: Esto muestra que las sondas para el alelo “T” han hibridado con éxito.
- Sin señal verde: No hay hibridación con el alelo “normal” (porque no está presente en la muestra).
Cómo funciona la detección, de las celdas de colores*
- En un microarreglo, cada SNP tiene dos sondas específicas: Una para el alelo “normal” y otra para el alelo “mutado”.
- El ADN de la muestra hibrida con las sondas complementarias en el chip.
- Los fluoróforos emiten señales dependiendo de qué alelo está presente en la muestra y será rojo o verde dependiendo del alelo presente
Definición de polimorfismo bialélico
- Un polimorfismo bialélico es una variación genética en la que solo existen dos versiones posibles (alelos) para un locus específico en el genoma.
- Como cada individuo tiene dos copias de cada cromosoma, las combinaciones de los dos alelos posibles generan los siguientes genotipos: CC / CA / AA
Cada celda del microarreglo está diseñada para detectar ________
- las dos posibles variantes del SNP (C y A en este caso) mediante oligonucleótidos específicos.
- Las señales fluorescentes de los fluoróforos permiten determinar cuál de los genotipos (CC, CA o AA) está presente en la muestra analizada.
Usos de los microarreglos
- Forense: El perfil genético permite identificar individuos mediante amplificación de microarreglos de SNPs (debido a su especificidad)
- Ciencias de la salud: Para el análisis de polimorfismos asociados a enfermedades metabólicas
Proceso de microarreglos de ARN:
- Extracción de ARN: Se obtiene ARN de un tejido específico en un momento determinado para estudiar la expresión génica.
- Cómo es inestable, lo pasamos a cDNA
- Adherencia del cDNA al microarreglo
- El mismo principio de hibridación
Principal uso de los microarreglos de ARN
- Expresión diferencial: Permiten comparar la expresión génica entre dif tejidos (p.ej: tejido sano vs tejido tumoral) para identificar genes diferencialmente expresados.
- Permite analizar tipo de tejido en un momento particular (tejido y tiempo específico)
Usos de microarreglos de RNA
- Análisis comparativos entre perfiles de expresión de cx sanas vs cx del px enf y tmbn entre tejidos
- Identificación de rutas metabólicas implicadas en enf
- Permite conocer la expresión diferencial entre un paciente y otro
-> la intensidad de la fluorescencia es direct proporcional al nivel de expresión del gen
Usos de microarreglos de RNA en microbiología
- Estudios de patogenicidad
- Resistencia bacteriana
Diferencias entre ARN y ADN en microarreglos:
Mientras los microarreglos de ADN se enfocan en genotipos (variantes genéticas), los de ARN se centran en los niveles de expresión génica.
-> además que el de RNA tiene limitación; la eficacia del análisis depende de la cantidad y calidad del cDNA generado a partir del ARN.
Posibles aplicaciones de los microarreglos
- Dx de enf de manera temprana
- Estudios de cáncer
- Guías de tx
- Estudio de nuevos fármacos
Definición de metilación:
Transferencia de grupos metilo al carbono 5 de la citocina presentes en las islas CpG.
-> ac y prot (histonas)
Es el donante de metilos
La S-adenosil metionina (SAM) y está mediado por ADN metiltransferasas
Efectos funcionales de la metilación
- Silenciamiento génico: La metilación puede inactivar genes
- Inhibición de FT: El grupo metilo bloquea la unión de FT a las secuencias promotoras, evitando la expresión génica.
Relevancia biomédica de metilaciones
Está altamente asociada al desarrollo de cáncer, ya que la metilación anormal puede silenciar genes supresores de tumores o activar oncogenes.
La metilación se analiza en _______
regiones río arriba del gen, como los promotores, donde afecta directamente la expresión génica.
herramienta ampliamente utilizada para estudiar patrones de metilación del ADN.
- Human Methylation 450 BeadChip desarrollado por Illumina
- Cubre el 99% de los genes referenciados y 250,000 islas CpG
Ambas tecnologías analizan los patrones de metilación en dinucleótidos CpG utilizando sondas específicas.
Tecnología Infinium I e Infinium II
-> La II usa una única sonda que puede detectar tanto sitios metilados como no metilados, basado en el cambio de bases por bisulfito
Conversión por bisulfito
Infinium II
- Identifica citocinas NO metiladas y las modifica por U o T
- Las citosinas metiladas permanecen sin cambios (C) y el bisulfito no actúa
-> permite diferenciar sitos metilados y no en el microarreglo (vemos la dif xq es el mismo fragmento)
