Generalidades Flashcards
Cromatina
DNA y proteínas asociadas: histonas
Nucleolo
Expresión de la síntesis de RNAr
Envoltura nuclear
Doble membrana que separa núcleo del citoplasma
Medio interno de la célula
Nucleoplasma
Ácidos nucleicos
Localizados en núcleo celular, mitocondria y cloroplastos
Dos tipos: DNA y RNA
Caract. de RNA
Transfiere la información contenida en el DNA
-Presente en prok, euk y virus
Localizado en núcleo, citoplasma, matriz mitocondrial
De que están compuestos los nucleótidos
Base nitrogenada (purinas, A y G)
Pirimidinas (C y T)
Pentosa (Ribosa y desoxirribosa)
Grupo fosfato con carga negativa -> se une con enlace fosfodiéster
Adenina con …
Citocina con …
Adenina con Timina (2)
CItocina con Guanina (3)
Una base purinica con una pirimidinica
A = T / C = G
Caract. de las bases nitrogenadas
Formadas por átomos de C y N
Purinas -> dos anillos condensados / C1 pentosa y N9 de purinas
Pirimidinas -> un solo anillo /C1 pentosa y N1 pirimidinas
Caract. de las pentosas
Ribosa: Pentosa de RNA, presenta un grupo OH en el carbono 2
Desoxirribosa: Pentosa de DNA, presenta un H en el carbono 2
¿Qué es un nucleósido?
Unión de una base nitrogenada y la pentosa
enlace covalente (N-glucosídico)
Nucleótido
Unión de grupo fosfato a un nucleósido
¿Qué es el genoma?
Conjunto de pares contenidas en el DNA de un organismo
Genoma del ser humano
3,000 millones de nucleótidos
23 pares de cromosomas
23,000 genes
Otras conformaciones del ADN
B-ADN: mas comun
A-ADN: una forma mas corta y ancha, en ADN deshidratado
Z-ADN: ayuda en proteccion de enferemedades virales, gira a la izquierda
Ómicas definición
Estudio de moléculas involucradas en el funcionamiento de un organismo (1980)
Estudio del genoma
Genómica
Transcriptómica
Cambio de expresión en los genes, ves a.a
Estudio de todas las moléculas de ARN en una célula.
-Se hace en tiempo y tejido específico
miRNA (21-25 nt)
lncRNA (más de 200 nt)
-> no codifican pero regulan la expresión
Proteómica o proteinómica
- Se usa para diagnóstico mediante biomarcadores (molecula de interés)
- Compara proteínas en una persona sana vs persona enferma para prevenir
- Proteínas se expresan en tejido y tiempo específico, identifica proteínas en muestras biológicas y modificaciones postraduccionales
Metabolómica
Estudios de los metabolitos derivados de un proceso biológico
Permite determinar cambios en los metabolitos en respuesta a una variación genética, estímulo físico o patológico
Epigenómica
Regulación de la expresión mediante plegamiento de DNA
Metilación de nt
Met o Acetilación de histonas
Programación fetal -> Ej: Desnutrición u obesidad
Nutrigenómica
- Cambios en la expresión de genes en respuesta al consumo de un alimento
- Cambios de expresión x consumo
¿Qué es la secuenciación?
metodología basada en métodos bioquímicos que determinan el orden exacto de las bases nitrogenadas en la cadena de ADN
¿Qué es la secuenciación de Sanger?
que usaba para flanquear
Técnica que permite determinar el orden exacto de los nucleótidos (A, T, C y G) en una cadena de ADN.
Mediante adición de ddNTPs
Usa oligos para flanquear, carece de adaptadores
En la metodología de secuenciación de Sanger, ¿Qué tipo de enlace se rompe para permitir la terminación de la cadena durante la síntesis de ADN?
Enlace fosfodiéster entre nucleótidos
En el proceso de secuenciación de Sanger, ¿Qué se utiliza para separar los fragmentos de ADN generados después de la terminación de la cadena?
Electroforesis en gel.
Nota: PCR se usa para amplificar una región específica de ADN, no para separar fragmentos de ADN según su tamaño
Cómo es la síntesis de ADN en Sanger
Un cebador (short DNA fragment) que se une a una región específica del ADN molde.
ADN polimerasa: una enzima que sintetiza una nueva cadena de ADN complementaria a la molde.
Desoxinucleótidos (dNTPs): las bases nitrogenadas (A, T, C y G) necesarias para construir la nueva cadena.
Didesoxinucleótidos (ddNTPs): moléculas similares a los dNTPs, pero que carecen de un grupo hidroxilo esencial para la elongación de la cadena. Cada ddNTP está marcado con un fluorocromo de un color diferente (uno para cada base).
¿Cómo se lleva a cabo la terminación de la cadena en Sanger?
A medida que la DNA pol sintetiza la nueva cadena, incorpora aleatoriamente ddNTPs. Cuando esto ocurre, la síntesis se detiene en ese punto, ya que el ddNTP carece del grupo hidroxilo (OH) necesario para añadir más nucleótidos.
Caract. de Sanger
No tiene adaptadores
1era generación
Secuenció al Genoma Humano.
- Adición de ddNTPS (no tienen OH): agrega nucleótidos -> dNTPs terminadores
- Basado en la replicación de la molécula de DNA con ayuda de DNA pol
- Cada ddNTPs están marcados al inicio radioactivamente
Metodología de Sanger
- La cadena de DNA debe de ser sencilla
- Fragmentos pequeños (50-300 nt)
- Al tener nt específicos permite ir separando por cadenas de dif tamaños
¿Cómo se le llama a la secuenciación que utilizó Sanger?
tecnica de secuenciacion de primera generación
¿Qué es un electroferograma?
(electroforesis capilar)
Representación visual de los datos obtenidos en la secuenciación de Sanger. En este gráfico, el eje X representa la longitud de los fragmentos de ADN y el eje Y representa la intensidad de la señal fluorescente.
Los fragmentos de ADN de diferentes longitudes se separan por electroforesis capilar
¿Cómo se relaciona con la secuenciación de Sanger? el electroferograma*
- Se obtiene una mezcla de fragmentos de ADN de diferentes longitudes, cada uno terminando en un ddNTP de un color específico
- A medida que los fragmentos migran a través del capilar, un láser excita los fluorocromos y un detector registra la señal fluorescente.
- Los datos de fluorescencia se procesan por un software para generar el electroferograma, que muestra los picos correspondientes a cada fragmento.
secuenciación automatizada
¿Cómo es la detección de la secuencia en Sanger?
Un láser excita los fluorocromos de los ddNTPs, y un detector registra la señal fluorescente. Un software analiza la secuencia de colores y determina la secuencia de nucleótidos original.
Se modificó la técnica de SANGER para realizar _______
La automatización (secuenciación automatizada)
-> Usa detectores automáticos que leen los colores de los fragmentos de ADN etiquetados, acelerando y aumentando la precisión del proceso en comparación con la secuenciación manual.
Caract. de la secuenciación automatizada
- Está basada en el mismo principio (SANGER) pero se modificó radioactividad por fluorocromos
- Permite amplificar hasta 96 muestras en una sola corrida, pero solamente fragmentos de 30-60 kb.
usamos PCR
Pasos de la secuenciación automatizada
1- PCR con ddNTPs con terminación de cadena fluorescente
2- Separación de tamaños por electroforesis capilar en gel
3- Excitación y detección por maquina secuenciadora
Next Generation sequencing (NGS)
- Técnicas de secuenciación posteriores a la secuenciación Sanger, que permite secuenciar múltiples sitios a escala masiva
- Millones a billones de fragmentos de DNA secuenciados en una sola reacción
NGS usa dos conceptos claves
- Cobertura -> promedio de número de lecturas que se alinean en una secuencia de referencia
Se lee a lo largo - Profundidad -> Se refiere al número de veces o repeticiones que ha sido secuenciado una base del genoma
NGS función
Secuencia múltiples sitios a escala masiva en una sola reacción
Tipos de de next generation sequencing (NGS)
todo lo que paso despues de Sanger
secuenciación de hibridación
→ 454 pirosecuenciacion solid (roche)
→ solexa (illumina)
→ PCR en emulsión Ion Torrent
secuenciacion de 1 molecula en tiempo real
Pirosecuenciación caract. clave
Secuencia fragmentos de 200-400pb
No utiliza gel de acrilamida
Reacción enzimática secuencial
Los ddNTPs que no se usan son degradados por apirasa
Al adicionar el nt a la cadena de DNA se libera pirofosfato (es el sustrato)
Y al final genera una luz
Cómo funciona la pirosecuenciación brevemente
- A medida que se añade cada nucleótido a la cadena de ADN en crecimiento, se produce una reacción enzimática que libera pirofosfato.
- Este pirofosfato es convertido en ATP por una enzima luciferasa, generando luz que es detectada permitiendo un seguimiento en tiempo real de la secuencia
fragmento de ADN se une a un micromolécula dentro de una emulsion
¿Qué es una biblioteca de DNA?
transformar un ADN, fragmentarlo y unirle los adaptadores
Ilumina: “SOLEXA” caract
2da generación (secuenciación por síntesis)
● Detecta la agregación de nucleótidos con marcadores de fluorescencia.
● Longitud de lectura limitada (200-250 pb).
● Alta tasa de error.
● Preparación de bibliotecas → generación de clústers → secuenciación → análisis
-Amplificación “en puente” o cluster PCR
utiliza placas
Amplificación “en puente” o cluster PCR
se cuentan con fragmentos (puentes) adheridos a una cx de flujo los adaptadores (primers) se unen una con otra complementandose y formando el puente
Solexa (Ilumina)
Pasos de Ilumina sequencing
En vez de micromolécula y emulsión son PCR en puentes, en placas, se usa fluoroforo
1- Preparación de la biblioteca: Fragmentación del ADN, adición de adaptadores
2- Clusterización: Fijación de fragmentos de ADN a una superficie sólida y amplificación para formar clústeres.
3- Secuenciación por síntesis: Incorporación de nucleótidos marcados fluorescentemente y detección de la señal.
4- Análisis de datos
Ion Torrent caract.
2DA GENERACIÓN (secuenciación por síntesis)
Da secuencias cortas.
● ADN tiene que prepararse con fragmentación para secuenciarse.
● Bibliotecas → perlas → censa cambios en el pH (iones).
Se trata de amplificar ADN dentro de pequeñas gotas de una emulsión
No utiliza marcadores fluorescentes, sino que detecta la liberación de protones durante la incorporación de nucleótidos. ¿De cuál estamos hablando?
Ion Torrent
- La incorporación de un nt correcto libera un protón, lo que genera un cambio de pH detectable (se registra como pico de voltaje)
Pasos de cómo llevar a cabo NGS
1- Fragmentación (sonicación) o con enzimas de restricción
2- Librerías: Agrego adaptadores/insertos para identificar y flanquear mi secuencia
código de barras permite escala masiva
3- Secuenciación: amplificación simultánea
PCR: Ilumina / Ion Torrent
4- Análisis
Sensibilidad
Parámetro de % de muestras positivas
Límite
Menor frecuencia de variante
Especificidad
Detecta controles negativos
Exactitud
Concordancia de mutaciones detectadas y esperadas
Precisión
Reproducibilidad de datos
SMRT
Secuenciación de una sola molécula en tiempo real
