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S.3 Genho&Protheo > Generalidades > Flashcards

Generalidades Flashcards

1
Q

Cromatina

A

DNA y proteínas asociadas: histonas

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Q

Nucleolo

A

Expresión de la síntesis de RNAr

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3
Q

Envoltura nuclear

A

Doble membrana que separa núcleo del citoplasma

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4
Q

Medio interno de la célula

A

Nucleoplasma

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5
Q

Ácidos nucleicos

A

Localizados en núcleo celular, mitocondria y cloroplastos
Dos tipos: DNA y RNA

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6
Q

Caract. de RNA

A

Transfiere la información contenida en el DNA
-Presente en prok, euk y virus
Localizado en núcleo, citoplasma, matriz mitocondrial

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7
Q

De que están compuestos los nucleótidos

A

Base nitrogenada (purinas, A y G)
Pirimidinas (C y T)
Pentosa (Ribosa y desoxirribosa)
Grupo fosfato con carga negativa -> se une con enlace fosfodiéster

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8
Q

Adenina con …
Citocina con …

A

Adenina con Timina (2)
CItocina con Guanina (3)
Una base purinica con una pirimidinica
A = T / C = G

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9
Q

Caract. de las bases nitrogenadas

A

Formadas por átomos de C y N
Purinas -> dos anillos condensados / C1 pentosa y N9 de purinas
Pirimidinas -> un solo anillo /C1 pentosa y N1 pirimidinas

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10
Q

Caract. de las pentosas

A

Ribosa: Pentosa de RNA, presenta un grupo OH en el carbono 2
Desoxirribosa: Pentosa de DNA, presenta un H en el carbono 2

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11
Q

¿Qué es un nucleósido?

A

Unión de una base nitrogenada y la pentosa
enlace covalente (N-glucosídico)

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12
Q

Nucleótido

A

Unión de grupo fosfato a un nucleósido

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13
Q

¿Qué es el genoma?

A

Conjunto de pares contenidas en el DNA de un organismo

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14
Q

Genoma del ser humano

A

3,000 millones de nucleótidos
23 pares de cromosomas
23,000 genes

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15
Q

Otras conformaciones del ADN

A

B-ADN: mas comun
A-ADN: una forma mas corta y ancha, en ADN deshidratado
Z-ADN: ayuda en proteccion de enferemedades virales, gira a la izquierda

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16
Q

Ómicas definición

A

Estudio de moléculas involucradas en el funcionamiento de un organismo (1980)

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17
Q

Estudio del genoma

A

Genómica

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18
Q

Transcriptómica

A

Cambio de expresión en los genes, ves a.a
Estudio de todas las moléculas de ARN en una célula.
-Se hace en tiempo y tejido específico
miRNA (21-25 nt)
lncRNA (más de 200 nt)
-> no codifican pero regulan la expresión

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19
Q

Proteómica o proteinómica

A
  • Se usa para diagnóstico mediante biomarcadores (molecula de interés)
  • Compara proteínas en una persona sana vs persona enferma para prevenir
  • Proteínas se expresan en tejido y tiempo específico, identifica proteínas en muestras biológicas y modificaciones postraduccionales
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20
Q

Metabolómica

A

Estudios de los metabolitos derivados de un proceso biológico
Permite determinar cambios en los metabolitos en respuesta a una variación genética, estímulo físico o patológico

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21
Q

Epigenómica

A

Regulación de la expresión mediante plegamiento de DNA
Metilación de nt
Met o Acetilación de histonas
Programación fetal -> Ej: Desnutrición u obesidad

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22
Q

Nutrigenómica

A
  • Cambios en la expresión de genes en respuesta al consumo de un alimento
  • Cambios de expresión x consumo
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23
Q

¿Qué es la secuenciación?

A

metodología basada en métodos bioquímicos que determinan el orden exacto de las bases nitrogenadas en la cadena de ADN

24
Q

¿Qué es la secuenciación de Sanger?

que usaba para flanquear

A

Técnica que permite determinar el orden exacto de los nucleótidos (A, T, C y G) en una cadena de ADN.
Mediante adición de ddNTPs
Usa oligos para flanquear, carece de adaptadores

25
Q

En la metodología de secuenciación de Sanger, ¿Qué tipo de enlace se rompe para permitir la terminación de la cadena durante la síntesis de ADN?

A

Enlace fosfodiéster entre nucleótidos

26
Q

En el proceso de secuenciación de Sanger, ¿Qué se utiliza para separar los fragmentos de ADN generados después de la terminación de la cadena?

A

Electroforesis en gel.
Nota: PCR se usa para amplificar una región específica de ADN, no para separar fragmentos de ADN según su tamaño

27
Q

Cómo es la síntesis de ADN en Sanger

A

Un cebador (short DNA fragment) que se une a una región específica del ADN molde.
ADN polimerasa: una enzima que sintetiza una nueva cadena de ADN complementaria a la molde.
Desoxinucleótidos (dNTPs): las bases nitrogenadas (A, T, C y G) necesarias para construir la nueva cadena.
Didesoxinucleótidos (ddNTPs): moléculas similares a los dNTPs, pero que carecen de un grupo hidroxilo esencial para la elongación de la cadena. Cada ddNTP está marcado con un fluorocromo de un color diferente (uno para cada base).

28
Q

¿Cómo se lleva a cabo la terminación de la cadena en Sanger?

A

A medida que la DNA pol sintetiza la nueva cadena, incorpora aleatoriamente ddNTPs. Cuando esto ocurre, la síntesis se detiene en ese punto, ya que el ddNTP carece del grupo hidroxilo (OH) necesario para añadir más nucleótidos.

29
Q

Caract. de Sanger
No tiene adaptadores

A

1era generación
Secuenció al Genoma Humano.
- Adición de ddNTPS (no tienen OH): agrega nucleótidos -> dNTPs terminadores
- Basado en la replicación de la molécula de DNA con ayuda de DNA pol
- Cada ddNTPs están marcados al inicio radioactivamente

30
Q

Metodología de Sanger

A
  • La cadena de DNA debe de ser sencilla
  • Fragmentos pequeños (50-300 nt)
  • Al tener nt específicos permite ir separando por cadenas de dif tamaños
31
Q

¿Cómo se le llama a la secuenciación que utilizó Sanger?

A

tecnica de secuenciacion de primera generación

32
Q

¿Qué es un electroferograma?
(electroforesis capilar)

A

Representación visual de los datos obtenidos en la secuenciación de Sanger. En este gráfico, el eje X representa la longitud de los fragmentos de ADN y el eje Y representa la intensidad de la señal fluorescente.
Los fragmentos de ADN de diferentes longitudes se separan por electroforesis capilar

33
Q

¿Cómo se relaciona con la secuenciación de Sanger? el electroferograma*

A
  • Se obtiene una mezcla de fragmentos de ADN de diferentes longitudes, cada uno terminando en un ddNTP de un color específico
  • A medida que los fragmentos migran a través del capilar, un láser excita los fluorocromos y un detector registra la señal fluorescente.
  • Los datos de fluorescencia se procesan por un software para generar el electroferograma, que muestra los picos correspondientes a cada fragmento.

secuenciación automatizada

34
Q

¿Cómo es la detección de la secuencia en Sanger?

A

Un láser excita los fluorocromos de los ddNTPs, y un detector registra la señal fluorescente. Un software analiza la secuencia de colores y determina la secuencia de nucleótidos original.

35
Q

Se modificó la técnica de SANGER para realizar _______

A

La automatización (secuenciación automatizada)
-> Usa detectores automáticos que leen los colores de los fragmentos de ADN etiquetados, acelerando y aumentando la precisión del proceso en comparación con la secuenciación manual.

36
Q

Caract. de la secuenciación automatizada

A
  • Está basada en el mismo principio (SANGER) pero se modificó radioactividad por fluorocromos
  • Permite amplificar hasta 96 muestras en una sola corrida, pero solamente fragmentos de 30-60 kb.

usamos PCR

37
Q

Pasos de la secuenciación automatizada

A

1- PCR con ddNTPs con terminación de cadena fluorescente
2- Separación de tamaños por electroforesis capilar en gel
3- Excitación y detección por maquina secuenciadora

38
Q

Next Generation sequencing (NGS)

A
  • Técnicas de secuenciación posteriores a la secuenciación Sanger, que permite secuenciar múltiples sitios a escala masiva
  • Millones a billones de fragmentos de DNA secuenciados en una sola reacción
39
Q

NGS usa dos conceptos claves

A
  • Cobertura -> promedio de número de lecturas que se alinean en una secuencia de referencia
    Se lee a lo largo
  • Profundidad -> Se refiere al número de veces o repeticiones que ha sido secuenciado una base del genoma
40
Q

NGS función

A

Secuencia múltiples sitios a escala masiva en una sola reacción

41
Q

Tipos de de next generation sequencing (NGS)

todo lo que paso despues de Sanger

A

secuenciación de hibridación
→ 454 pirosecuenciacion solid (roche)
→ solexa (illumina)
→ PCR en emulsión Ion Torrent
secuenciacion de 1 molecula en tiempo real

42
Q

Pirosecuenciación caract. clave

A

Secuencia fragmentos de 200-400pb
No utiliza gel de acrilamida
Reacción enzimática secuencial
Los ddNTPs que no se usan son degradados por apirasa
Al adicionar el nt a la cadena de DNA se libera pirofosfato (es el sustrato)
Y al final genera una luz

43
Q

Cómo funciona la pirosecuenciación brevemente

A
  • A medida que se añade cada nucleótido a la cadena de ADN en crecimiento, se produce una reacción enzimática que libera pirofosfato.
  • Este pirofosfato es convertido en ATP por una enzima luciferasa, generando luz que es detectada permitiendo un seguimiento en tiempo real de la secuencia
    fragmento de ADN se une a un micromolécula dentro de una emulsion
44
Q

¿Qué es una biblioteca de DNA?

A

transformar un ADN, fragmentarlo y unirle los adaptadores

45
Q

Ilumina: “SOLEXA” caract

A

2da generación (secuenciación por síntesis)
● Detecta la agregación de nucleótidos con marcadores de fluorescencia.
● Longitud de lectura limitada (200-250 pb).
● Alta tasa de error.
● Preparación de bibliotecas → generación de clústers → secuenciación → análisis
-Amplificación “en puente” o cluster PCR

utiliza placas

46
Q

Amplificación “en puente” o cluster PCR
se cuentan con fragmentos (puentes) adheridos a una cx de flujo los adaptadores (primers) se unen una con otra complementandose y formando el puente

A

Solexa (Ilumina)

47
Q

Pasos de Ilumina sequencing

A

En vez de micromolécula y emulsión son PCR en puentes, en placas, se usa fluoroforo
1- Preparación de la biblioteca: Fragmentación del ADN, adición de adaptadores
2- Clusterización: Fijación de fragmentos de ADN a una superficie sólida y amplificación para formar clústeres.
3- Secuenciación por síntesis: Incorporación de nucleótidos marcados fluorescentemente y detección de la señal.
4- Análisis de datos

48
Q

Ion Torrent caract.

A

2DA GENERACIÓN (secuenciación por síntesis)
Da secuencias cortas.
● ADN tiene que prepararse con fragmentación para secuenciarse.
● Bibliotecas → perlas → censa cambios en el pH (iones).
Se trata de amplificar ADN dentro de pequeñas gotas de una emulsión

49
Q

No utiliza marcadores fluorescentes, sino que detecta la liberación de protones durante la incorporación de nucleótidos. ¿De cuál estamos hablando?

A

Ion Torrent
- La incorporación de un nt correcto libera un protón, lo que genera un cambio de pH detectable (se registra como pico de voltaje)

50
Q

Pasos de cómo llevar a cabo NGS

A

1- Fragmentación (sonicación) o con enzimas de restricción
2- Librerías: Agrego adaptadores/insertos para identificar y flanquear mi secuencia
código de barras permite escala masiva
3- Secuenciación: amplificación simultánea
PCR: Ilumina / Ion Torrent
4- Análisis

51
Q

Sensibilidad

A

Parámetro de % de muestras positivas

52
Q

Límite

A

Menor frecuencia de variante

53
Q

Especificidad

A

Detecta controles negativos

54
Q

Exactitud

A

Concordancia de mutaciones detectadas y esperadas

55
Q

Precisión

A

Reproducibilidad de datos

56
Q

SMRT

A

Secuenciación de una sola molécula en tiempo real

S.3 Genho&Protheo (18 decks)

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