Interacciones prot-prot Flashcards
¿El conocimiento de la secuencia nucleotídica y transcriptómica de una proteína es suficiente para conocer su función?
Falso
(Se requiere saber cómo interactúa con otras proteínas)
Clasificación de la interacción de las proteínas
- Dominios de la misma cadena polipeptídica
- Dominios de diferentes cadenas polipeptídicas
- En complejos formados entre proteínas independientes
Metodologías para evaluar las interacciones proteína-proteína
Rayo X
ELISA
Doble híbrido Y2H
Microarreglo de proteínas
Microscopía electrónica
Inmunofluorescencia
FRET
Técnica Y2H (Yeast Two Hybrid Screening) ¿Qué es?
Es una técnica de doble híbrido en levadura que detecta la interacción entre dos proteínas.
Principio de funcionamiento
Y2H
El factor de transcripción (GAL4) se separa en dos partes:
Dominio de unión a ADN (BD).
Dominio de activación (AD).
-> ambos tienen que estar juntos para que se lleva a cabo la transcripción
-> Estos dominios se unen a las proteínas que se desea analizar.
Y2H audio explicativo**
que ocurre si hay interaccion entre prot
ver si proteínas interactúan biotina y estraptividina
-> para probarlo les pego una prot a lo que yo se que se va a unir al DNA
si hay interacción se unen las prot, y se pega los dos dominios del FT, el que se une al DNA y el que activa
-> como resultado tengo un transcrito
si no interactúan no hay transcripción
Si las proteínas interactúan ____________
Y2H
Los dominios del factor de transcripción se unirán.
Esto activará la transcripción de un gen reportero.
Resultado visible
Y2H
La interacción entre las proteínas se detecta al observar la transcripción del gen reportero
¿Qué es un gen reportero?
- Es un gen cuya expresión se utiliza como indicador para determinar si ocurre un proceso específico, como la interacción entre proteínas.
- Produce un producto fácilmente detectable (p.ej, una proteína fluorescente o una enzima) que confirma la activación transcripcional en el experimento.
Técnica FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Es un método microscópico que permite monitorear la interacción proteína-proteína en tiempo real.
-> mide la interacción en tiempo real; si su naturaleza es interactuar durante 1h, veo fluorescencia 1h
Marcaje de proteínas
FRET
- Las proteínas se marcan con fluoróforos (donadores y aceptores).
- Cuando interactúan, ocurre transferencia de energía y se observa fluorescencia.
Proceso experimental
FRET
- CFP (Cyan Fluorescent Protein) se excita a 436 nm (luz azul) y emite a 480 nm.
- Si hay interacción, YFP (Yellow Fluorescent Protein) (aceptor) se excita a 480 nm y emite luz amarilla.
Ventajas
FRET
Permite medir el tiempo de interacción entre las proteínas.
FRET describe los pasos
- Fluoroforo donante se activa a longitud de onda de 436nm y emite luz a 480nm
- como investigadores pongo longitud de onda de 436 para que florezca
- si hay interacción, prot 2 ocupa un fluoroforo aceptor (acepta una energía del fluroforo donador)
la fluorescencia que se emite del CFP es de 480nm, el recibe a 436
-> coincide con la energia que ocupa el fluoroforo para activarse
-> esa fluroescencia de 480 es absorbida por YFP y emite 535 (solo en el momento que están pegados interactuando); debe haber proximidad
Modificaciones postraduccionales
Procesos que alteran la estructura de las prot posterior al proceso de traducción
¿Qué pueden incluir las modificaciones postraduccionales?
- Adición de grupos químicos
- Cortes de cadena polipeptídica
- Plegamiento
Las modificaciones postraduccionales determinan _________
- Actividad
- Localización
- Interacciones con otras proteínas
-> Ej. cascada de cinasas se regula mediante fosforilaciones
Modificaciones postraduccionales en el análisis proteómico (6)
- Fosforilación: en tirosina, serina y treonina.
Regula la activación o desactivación de la actividad enzimática. - Acetilación: Aumenta la estabilidad de proteínas. Regula la interacción proteínas-ADN (como en histonas).
- Glicosilación: adición de carbohidratos a una proteína. Mejora su solubilidad y estabilidad.
- Metilación: Regula la transcripción.
- Acilación: Implica la modificación de lípidos.
Está asociada a la localización y anclaje en membranas. - Ubiquitinación: Marca a las proteínas para su degradación.
Western Blot pasos audi*
lisis con buffer -> se centrifuga para separa prot
-> hacemos del de acrilamida; permite identificar por peso -> SDS page (gel que se utiliza para analizar prot)
SDS -> detergente para eliminar estructura 2° de prot (se abre la prot; ver tamaño y estructura)
prot separada por tamaño - aislo prot, cuál está PO-4; transfiero a una membrana, con papel filtro, le añado solución con un Ac
-> Ac detecta si está o no fosforilado pues es mod. postraducciones (WB analiza prot)
-> buscamos mod. postraduccionales
-> mi Ac tiene un anti-Ac marcado con fluoroforo radioactivo
-> si hay fosforilación se pega Ac y habrá radioactividad; si no el Ac no se pega
Western Blot qué es
Es una técnica de detección de proteínas.
-> tmbn identifica mod. postraduccionales
Proceso de Western Blot
- Las proteínas se separan por medio de electroforesis en gel.
- Posteriormente, se transfieren a una membrana.
- La membrana es expuesta a un anticuerpo específico.
- La unión entre el anticuerpo y la proteína de interés se detecta utilizando un marcador radioactivo
Objetivo principal de la proteómica
Identificación de proteínas y función
¿Qué es la proteómica subcelular?
Estudio de proteínas a nivel de los organelos
-> análisis de proteínas en organelos
¿Qué prot comparto en la mitocondria y en AG, son iguales, funcionan igual, misma cantidad?
Es el estudio de las proteínas a nivel de los organelos
Proteómica subcelular
¿Cómo se detecta el proteoma subcelular?
Inmunofluorescencia
Ac
(hacia proteínas subcelulares)
Secuencia nucleotídica: con primers/oligos
¿Cómo se detecta el proteoma subcelular?
Fraccionamiento bioquímico
Fraccionar cx bioquímicamente (detergentes específicos)
¿Cómo se detecta el proteoma subcelular?
Etiquetado por proximidad
Etiquetado con biotina
Define biomarcadores
Marcadores que se pueden utilizar en medicina para la detección precoz, el diagnóstico, la estadificación o el pronóstico de enfermedades
¿Qué factores se pueden usar como marcadores?
Metabolitos
Péptidos, proteínas
Medidas de propiedades físicas
Se aceleró enormemente con el desarrollo de las tecnologías ómicas
El descubrimiento de biomarcadores
Los biomarcadores pueden proceder del ⎽⎽⎽⎽ o reflejar la reacción del ⎽⎽⎽⎽ frente a la ⎽⎽⎽⎽
Propio proceso biológico
Cuerpo
Enfermedad
¿Dónde se pueden encontrar los biomarcadores dentro del cuerpo humano?
Líquidos biológicos y tejidos (orina, plasma, saliva, líquido intersticial, aspirados de mama, LCR)
