M6 Basal toxikologi Flashcards
Kroppens væskebalance reguleres i høj grad af nyrerne, som filtrerer blodet og styrer udskillelsen af overskydende væske gennem urinen.
Vandindtag mindre end 1 liter pr. time: Hvis en person indtager mindre end 1 liter vand pr. time, vil kroppen forsøge at kompensere for dette ved at bevare så meget væske som muligt.
Vandindtag større end 1 liter pr. time: Hvis vandindtaget overstiger 1 liter pr. time, vil det medføre en stigning i væskemængden i blodbanen. Dette fører til en lavere koncentration af natriumklorid (NaCl) i blodet, hvilket igen resulterer i, at væske siver ud fra blodbanen og ind i cellerne.
Celler i CNS opsvulmer og klemmes pga begrænset plads → CNS symptomer som koma og død.
Man kan derfor dø af at drikke for meget vand.
Et stofs toksicitet afhænger primært af eksponeringsniveauet samt dets kemiske egenskaber, koncentration, varighed af eksponering og måden, hvorpå det indtages. Individuelle faktorer som alder, helbred og genetisk disposition kan også spille en rolle.
Toksikokinetik:
Toksikokinetik fokuserer på tilstedeværelsen af giftstoffer i forskellige medier som luft, vand, mad osv. og mekanismer, der påvirker optagelse, distribution, metabolisme og udskillelse af disse toksiner.
Faktorer der påvirker TK: Distribution, dosis, doseringshyppighed, species, alder, køn, sygdomsstatus, næringsstatus, fysiokemiske egenskaber, administrationsvej, udskillelse, tidligerer eksponering.
For at bestemme kinetikken udføres seriel aflivning, hvor koncentrationen af teststof og metabolitter måles i blod/væv. Ekskretion af teststof + metabolitter måles via metabolisme kamre af opsamlet urin/fæces/udånding.
Toksikokinetik er kompleks af:
* Absorption, mængde og hastighed afhænger absorptionsvej
* (oral, inhalering, dermal, injektion)
* Distribution i kroppen (eksponeringslængde og intensitet)
* Metabolisme (evt. toksiske metabolitter)
* Elimineringshastighed, T½ (urin, fæces, udånding)
Toksiko-dynamik:
Toksiko-dynamik handler om dosis på flere niveauer, lige fra kritisk makromolekylær til væv til hele kroppen. Det undersøger også mekanismer, der fører til ændringer i funktioner og struktur, samt akutte og kroniske respons, herunder funktionelle effekter og risiko for kræft.
Opdeles i systemisk og lokal effekt
Systemisk effekt
* effekt andre steder end der hvor initiel eksponering og absorption har fundet sted
* stofferne absorberes og fordeles så hele organismen påvirke (organspecificitet)
Lokal effekt: Overskride beskyttende barriere
* Diffusion (f.eks. indånding af nitrøse gasser)
* Ødelægge barrieren (stærke syrer/baser)
Hvad er afgørende for om et fremmedstof når et påvirkeligt område i en tilstrækkelig høj koncentration I tilstrækkelig lang tid?
For at et fremmedstof når et påvirkeligt område i tilstrækkelig høj koncentration i tilstrækkelig lang tid er det afgørende, at det bliver optaget, distribueret, metaboliseret, og udskilt korrekt i kroppen, samt at eksponeringen varer længe nok og i tilstrækkelig høj koncentration.
Hvad er forskellen på PK/PD og TK/TD?
PK/PD (Pharmacokinetics/Pharmacodynamics) fokuserer på, hvordan kroppen påvirker et lægemiddel og hvordan lægemidlet påvirker kroppen. TK/TD (Toxicokinetics/Toxicodynamics) handler om, hvordan kroppen påvirker et giftstof og hvordan giftstoffet påvirker kroppen. Begge sæt af begreber er vigtige for at forstå virkningen af stoffer på kroppen, enten terapeutiske eller toksiske.
Risikovurdering:
Risikovurdering dækker alle disse områder og er en bred analyse af toksicitet og de potentielle sundhedsmæssige risici, der er forbundet med eksponering for forskellige stoffer og miljøforhold.
LD LDn Letal tærskelværdi
LD: Lethal dose
LDn: LDn lethal dose for n% af populationen. n% af populationen. Eks. LD50 = lethal dose for 50% af populationen
LD50 bruges til at vurdere stoffers giftighed. I akutte toksicitetstest bestemmes den dosis af stof, der skal indgives til en gruppe dyr, for at halvdelen af dyr dør. Det er dog meget uetisk. Idag anvendes primært Fixed Dose, der bruger få dyr.
Letal tærskelværdi:
Letal tærskelværdi (nedre dosisgrænse, inden letal effekt). Ofte anvendes andre responsvariable for effekt i stedet for død f.eks. kliniske tegn
Ex. 2 stoffer A og B kan have samme LD50 men forskellig letal tærskelværdi - hvilket er mest toxisk? Det er stof A med den laveste letale tærskelværdi. Stof B har det smalleste terapeutiske index.
Et stof skal klassificeres med GHS via akut toksicitetstest. Idag anvendes Fixed dose studer istedet for LD50 for at minimerer brugen af forsøgsdur. Formålet med Fixed dose er at etablerer MTD maximum tolerated dosis.
TD TDn, ED EDn TI Hazard, Risk, NOEL NOAEL, LOAEL, ADI, MRL
TD/TDn: Toxic dose
ED/EDn: Effective dose
TI Therapeutisk index TD50/ED50
Terapeutisk index IT er forholdet mellem det terpaitiske og toksiske dosis TD50 el. letale dosis LD50. Der kan enten være en 1) Safety based TI LD50/ED50 for sikkerhed, eller 2) efficacy based TI TD50/ED50.
Hazard: ”Farlighed”. Potentialet for at en agens forårsager en uønsket effekt
Risk: Sandsynlighed for en agens forårsager en uønsket effekt, ved en specifik eksponeringsintensitet og varighed
NOEL: No Observed Effect Level den højeste dosis/koncentration af et stof, hvor der ikke observeres nogen effekt
NOAEL: No Observed Adverse Effect Level den højeste dosis/koncentration af et stof, hvor der ikke oberserveres nogen uønsket effekt
LOAEL: Low Observed Adverse Effect Level den højeste dosis/koncentration af et stof hvor der observeres en lav uønsket effekt
ADI:
Acceptabel daglig indtagelse (fødevarer, pesticider). NOAEL er basis for at kunne beregne Acceptable Daily intake (ADI), som er vigtig for fastsættelse af MRL værdier og tilbageholdelsestider
MRL: Maximum residue level (maksimal grænseværdi)
Benchmark dose:
Benchmark Dose er et statistisk modelleret estimat af NOAEL som bruges indenfor fødevaresikkerhed til beregning af tilbageholdelsestid
Mutagen vs carcinogen
Mutagener:
Et mutagen er et biologisk, fysisk eller kemisk agens der medfører permanente ændringer i genom. De fleste mutagener er også carcinogene. Ex. inkluderer radioaktive stoffer, røngtenstråling, UV stråling, kemikalier, metaller, virus.
Carcinogener:
Et carcinogen er et agens der medfører cancer. Fører enten til elelr fremmer udvikling af cancer. Ikke alle carcinogene er mutagene. Ex. Rygning, stråling, patogener, miljøpåvirkninger, kost. Medfører tumordannelse el. cancer.
🌸In vitro test
In silico studier: Structure-activity analyses fra store databaser
In vitro studier: Cellekultur, Vævskultur, Organ studier
In vitro toksikologiske test:
Fordele:
・ Billig, Relativt simple, Kontrolleret miljø, Ingen/færre brug af forsøgsdyr (3R)
Ulemper:
・Mangler systemisk effekt, herunder metabolisme
・Mangler celle-til-celle interaktioner
・Kræver sterilt miljø (Mycoplasma kontaminering)
・Ekstrapolering fra in vitro til in vivo
Cellekulturer (vævsdyrkning) dannes ved permanente cellelinjer ex. HEK293 (Human Embryonic Kidney cells), CHO cells (Chinese Hamster Ovary cells), HeLa cells (Henrietta Lacks*).
Fra primære cellekulturer tages vævbiopsi, hvilket frigiver specifikke celler og man sortere celler via FACS fluorescense activated cell sorting.
Organkultur eks. Langendorf-hjertemodel
Stamcellekulturer eks. hiPSCs (human induced pluripotent stem cells
End-points i in vitro toxikologiske test: I toksikologiske in vitro test refererer et “endpoint” til et specifikt mål eller en målbar biologisk effekt, som eksperimentet sigter mod at observere eller kvantificere.
Celleviabilitet: Bestemmer antal celler i et tællekammer (celler/ml) evt. tælles antal celler som optager farven trypanblå (døde).
Membranlækage: frigivelse af makromolekyler fra cellen til vækstmedie pga tidligere membranskader
Cellevækst og proliferation
Cellemorfologi
Metaboliske assays
Genekspression
Krav til in vitro endpoints
・Skal udvise dosis-respons forhold
・Skal afspejle in vivo effekt (eks. en specifik valideret mekanisme)
・Skal være målbare og reproducerbare (eks. luminescens)
・Skal have intern kontrol
In vitro toksikologiske test: Er ofte simulerede levermetabolismer i et kammer ved diffusion af toxiner og metabolitter til målceller. Laves i en petriskål der celler et cellemonolag med vækstmedie. Toxiner tilsættes cellekulturen med hepatocytter og microsomer. Via microporøse barrirere tillades passage af toxiner som diffunderer mod targetceller.
Opsummering af in vitro test:
* In vitro tests (med stigende kompleksitet) bruges inden in vivo tests for at undgå at teste stoffer med høj toksicitet
* Undgå unødig lidelse
* Ingen (færre) brug af forsøgsdyr (3R)
* Udviklingen af in vitro assays er dynamisk
Udfordringer: * Validering af in vitro assays og * Ekstrapolering mellem in vitro og in vivo
* In vivo tests vurderes stadig uerstattelige
🌸In vivo studier
Formål med in vivo studier: Etablere dosis-respons forhold og bestemme NOAEL
In vivo toksiko dynamik studie - etablerer doseresponskurven m. Endpoints: For at definere et stofs toksicitet el. dets kliniske effekt anvender vi endpoints.
End-points: en hændelse eller et resultat, der kan måles objektivt for at afgøre, om interventionen, der undersøges, er gavnlig (kliniske studie) eller toksisk (toksikologiske studier)
End-points er en sammenfatning af kliniske og terminale observationer. Ved et in vivo toksikodynamisk studie, hvor man etablerer dose-responsforhold, undersøger man virkningerne af et stof i levende organismer. De endpoints, der vurderes, inkluderer biokemiske analyser, organers tilstand, histologi, organsystemer og kliniske observationer.
Kliniske observationer: Nedstemthed, ændring i biokemisk profil
Terminal observation: Specifik organ patologi, celleforandringer
NOAEL/LOAEL:
Baseret på observerede endpoints defineres en dosis, der ikke giver adverse effekter (NOAEL) el. lave adverse effekter LOAEL. NOAEL/LOAEL kan kun være én af de anvendte doser i studiet.
Hvad forstås der ved NOAEL?
NOAEL etableres i in vivo toksikologiske studier. Det er basis for at beregne FIH First in human dose.
I in vivo test er det vigtigt at tage højde for
* Arts selektion: Ofte test i både gnavere (mus/rotte) og ikke-gnavere (hund/gris/abe) – typisk raske dyr
* ‘Guide for the care and use of laboratory animals’ (ILAR, 2010)
* 3R: Reduction, refinement, replacement
* Good laboratory practice (GLP) – sikrer kvalitet og reproducerbarhed af data (krav)
* Study director
* Quality assurance (QA) unit
* Documented standard operating procedures (SOPs)
* Written protocol
* Final report with QA statement
* GLP not required by Food and Drug Administration (FDA) on
domestic livestock studies.
* CRO = Contract Research Organisations
* Most GLP in vivo tox studies are performed at CROs
In vivo toksikologiske tests: Valg af administrationsvej – relevante eksponeringsveje
Akutte studier (MTD etablering)
“Single dose” akut toksicitet (OECD 401, udgået):
Undersøger akut toksicitet, ved ‘single dose’. Formål: Etablere LD50/tydelig toksicitet som kan bruges til at klassificere et stof i GHS* og/eller til efterfølgende subkronisk og kronisk toxicitetstests
Max. dosis i Gnavere: 2000 mg/kg/d, Andre dyr: 1000 mg/kg/d, Dosis ofte med 50 X klinisk dosis
Antal dyr: mindst 10 mus eller 5 rotter pr. gruppe. Begge køn
Observation 24 timer – 14 dage
Akut “fixed dose” toksicitet (OECD 420):
Formål: Etablere en Maximum tolerated dosis (MTD), ikke LD50
Initial dosis er udvalgt til at give tegn på toksicitet, men uden at føre til alvorlig toksiske effekter eller mortalitet.
Dosis: 5, 50, 300 eller 2000 mg/kg/d. Efterfølgende doser er højere eller lavere end initial dosis
Dyr: rotte, (mus), Køn: hunner da de er mere sensitive, (han). Antal dyr: 5/dosis. Observation: 24 t – 14 d
Et studie skal fastsætte maksimal tolerabel dosis MTD i rotter forud for det subkroniske toksikologi studie med en ny lægemiddelkandidat.
Subkroniske studier
Subkroniske studier (repeated dose) 90 dage.
Overvejelser til subkroniske og kroniske studier:
Administrationsvej, hyppighed, dosis response, tidsprøve-tagning, MTD, kendskab til virkningsmekanismen, multiple aflivninger ved forskellige doseringslængder, reversibilitet (inkl. recovery dyr) og guidelines for forskellige typer toksicitet (ex. genotox/reprotox/carcinogenicitet), samt Endpoints og biomarkører.
Dosisvalg og studiedesign: Dosisvalg er vigtig når man vælger repeated dose studier.
* Høj dosis kan være bestemt ud fra akut tox studie hvor den maksimalt tolereret dosis bestemmes (MTD), * Max. tolerated dose (MTD), * Max. feasible dose (MFD), * ICH M3, Mean exposure margin 50x clinical exposure (50 x den dosis som skal anvendes i de kliniske forsøg), * Lav dosis i terapeutisk relevant range
Subkroniske studier følger OECD guidelines 408 og 409:
* Mindst 10 af hvert køn pr gruppe (gnavere), mindst 4 af hvert køn (ikke-gnavere)
* Mindst 3 doseringsniveauer (evt. Baseret på tidligere tests)
* Rask kontrolgruppe (ubehandlet eller vehicle)
* Doseringshyppighed: dgl. 7 dage om ugen i min 90 dage (ændringer kræver argumentation)
* Observation: 90 dage
* Endpoint: Kliniske og terminale observationer (mere om dette senere)
Kroniske
Kroniske studier 6-24 mdr.
Overvejelser til subkroniske og kroniske studier:
Administrationsvej, hyppighed, dosis response, tidsprøve-tagning, MTD, kendskab til virkningsmekanismen, multiple aflivninger ved forskellige doseringslængder, reversibilitet (inkl. recovery dyr) og guidelines for forskellige typer toksicitet (ex. genotox/reprotox/carcinogenicitet), samt Endpoints og biomarkører.
Dosisvalg og studiedesign: Dosisvalg er vigtig når man vælger repeated dose studier.
* Høj dosis kan være bestemt ud fra akut tox studie hvor den maksimalt tolereret dosis bestemmes (MTD), * Max. tolerated dose (MTD), * Max. feasible dose (MFD), * ICH M3, Mean exposure margin 50x clinical exposure (50 x den dosis som skal anvendes i de kliniske forsøg), * Lav dosis i terapeutisk relevant range
Kroniske studier følger OECD guidelines 452:
* Mindst 20 af hvert køn pr dosis gruppe (gnavere), mindst 4 af hvert køn pr dosis gruppe (ikke-gnavere)
* Mindst 3 doseringsniveauer (baseret på tidligere tests), maks dose 1000 mg/kg bw/dag
* Doseringshyppighed: dgl. 7 dage om ugen ofte i 12 måneder, men afhænger af studiets varighed
* Endpoint: Kliniske og terminale observationer (mere om dette senere)
End-points til in vivo toksikologiske test med gentagne doseringer:
Kliniske obs: Kropsvægt, fødeindtag, Ophthalmoscopy, ECG, Haematology, Klinisk kemi, Urinanalyse, Toxicokinetik, Antistof Analyse
Terminale obs: Obduktion, Makroskopiske fund, organvægte, hisopatologi af 50 organer/væv.
Studie konklusion: Alle data indsamles til NOAEL som er den dosis hvor man ikke observerer nogle adverse effekts.
Safety margin
Startdosis til human afprøvnign estimeres udfra NOAEL korrigeret med HED (human equivalent dose) og divideret med en safety factor SF. SF mellem dyr og mennesker er ofte 10 (interspecies), SF individual variation ofte 10 (intraspecies).
Dosis-respons og etablering af NOAEL fra in vivo:
POD=point of departure, etableret fra eksperimentielt data for at finde et sikker dosis niveau
RfD= Reference dose
BMD = Benchmark Dose (estimat af NOAEL) som bruges i fødevaresikkerhed
NOAEL kan kun være én af de testede doser, derfor en fordel med BMD
Varighed af repeat dose toksikologisk studie til support af humane kliniske trials (ICHM3) og behandling af dyr
- Hvor lang tid skal man mindst have doseret forsøgsdyr forud for 28 dages behandling i en human klinisk afprøvning af et nyt lægemiddel? - 28 dage.
- Hvor lang tid skal man have doseret hunde med et nyt lægemiddel, der skal registreres til dosering af hunde i maksimalt 5 dage? - 15 dage.
Pivotal margin of safety study in target animal with doses 0X, 1X, 3X and 5X the therapeutical dose administered for 3X the intended duration.
Test for genotoksicitet
Formålet med en genotoksicitet test er at vurdere mulig toksisk effekt på genetisk materiale in vitro og in vivo. Undersøges typisk via punktmutationer og kromosomforandringer, herunder brud på DNA.
Standard laves følgende in vitro test.
enten Ames eller Mikronukleus test
Ames test (in vitro genotoksicitets-test)
Ames test OECD TG 471: Undersøger om mutagen kan reversere mutationen i Salmonella Typhimurium, hvilket medfører aminosyresyntese og reverserer mutationen. Laves på bakterier.
I en Ames test (test for genotoksicitet) kan man undersøge om et stof er mutagent, samt eksponere det potentielle mutagene stof for leverekstrakt, for at se om der dannes metabolitter der kan være genotoksiske.
Man benytter Salmonella typhimurium, som har en punktmutation, der medfører at de ikke kan syntetisere aminosyren histidin. S. typhymurium kan derfor ikke lave proteiner, og dermed vil der ikke være vækst. Man udsår disse S. typhimurium på et histidinfattigt medie sammen med det stof, man ønsker at undersøge for at være genotoksisk/mutagent. Hvis stoffet er mutagent, vil det revertere bakteriernes mutation, så de vil begynde at syntetisere histidin og der vil ske vækst. Det er vigtigt at foretage testen både med og uden leverekstrakt, for at undersøge om det er “parent compound” eller metabolitter, der er genotoksisk. Fordi de fleste mutagene og toksiske stoffer først bliver aktive efter metabolisering (ex. oxidation eller konjugation) simuleres der en levermetabolisme, under Ames-test, ved at tilføje leverekstrakter (lever-cellekulturer med tilhørende enzymsystemer), der kan metabolisere det mutagene stof til en evt. toxisk metabolit og deraf mimikere levermetabolismen.
Mikro nukleus test
Mikronukleus test OECD TG 487: Undersøger mammale (rotter/humane) cellekulturer for eksponering af teststof, og derefter undersøges der for mikronuklei og kromosomskade.
Mikronukleus test tester for genotoksicitet og formålet er at vurdere mulig toksisk effekt på genetisk materiale når hele organismen eksponeres (tager højde for ADME).
Ofte anvendte in vivo test:
1) Erythrocyt-mikronukleus test OECD TG 474: som tester et stofs potentiale til at inducerer kromosomskade (dannelse af micronucleus). Immature erythrocytter i knoglemarven har en kerne i cytoplasma. Ved DNA skade af nuklerede erythrocytter kan der dannes kromatinrester som benævnes mikronukleus. Erythrocytter afgiver efter deres sidste deling deres kerne. Af ukendte årsager forsvinder mikronukleus ikke i de modne erythrocytter og kan derfor bruges som indikation på genotoksicitet.
Forløb: 1) mus eksponeres, 2) eutanasi, 3) benmarv fra lårknogle udsuges, 4) udstrygningspræperat fremstilles og farves 5) Polykromatiske erythrocytter analyseres for mikronuklei.
2) Knoglemarvs micronucleus test (OECD TG 475), som tester et stofs potentiale til at inducerer kromosomforandringer i testdyr
3) Alkalisk comet assay (OECD TG 489), til identifikation af brud på DNA streng, ofte anvendes gnavere der behandles med teststof, der udtages enkeltceller fra relevant væv og DNA isoleres, DNA eksponeres for alkalisk miljø hvorved det udfoldes, afbrækkede DNA stykker kan derefter detekteres vha. elektroforese
Toksikokinetiske studer
In vivo studier:
Varighed
an være nødvendigt at ekstrapolere mellem arter
In vivo studier opdeles i 4 kategorier:
akut: ofte <24 timer
subakut: Ofte 2-4 uger
subkronisk: Ofte 1-3 måneder
kroniske: Ofte > 3 måneder; ofte 2 år
Kan også beskrives med antal dage f.eks. et 90 dages studie
Reproduktions toksikologiske test
Formål: At vurderer mulig tocisk effekt på reproduktionsorganer, både funktionelle og strukturelle effekter (han/hun). Ofte anvendes rotter og mus, og man laver typisk multigenerationsstudier (min. 2. gen).
Effekt: Premating, matingGD0, implantation GD6, end of organogenesis GD17, C-section GD20, Birth GD21, weaning LD21.
Ex. bruges in vitro forsøg til reproduktionstoksikologi ved
1) Pyrethroider som anvendes som pesiticer ex. deltamethrin er under mistanke for at have effekt på hanlig kønsudvikling.
2) Test for stoffer med androgen effekt. Hæmning af androgen receptor er relateret til nedsat fertilitet hos hankøn. Assayet bruges til at teste pesiticer (pyrehtroider). CHO celler transfekteret med en human androgen recepto hAR som er en transkriptionsfkator. Ved ligangsbinding transkriptere den hAR rapportergenet luciferace hvis produkt kan måles med et luminometer.
Teratogenicitets test
Formål: At vurdere mulig toksisk effekt på foster (fra zygote til neonatal)
Både funktionelle og strukturelle effekter. Fase med organogenese er afgørende.
Art: Oftest rotter, mus og kaniner (non-rodent, thalidomid
Stoffer betegnes teratogene på baggrund af: Strukturelle deformiteter, Vækst hæmning, Foster død
Stoffer betegnes som teratogene og/eller føtotoksiske.
Når man tester for teratogen effekt testes følsomhedden overfor teratogen effekt over tid.
Befrugtning og implementation påvirkes typisk ret lidt, men i takt med embryoudvikling stiger følsomhed for teratogen effekt markant = Organogenese!
I skiftet mellem embryo til foetus falder følsomheden overfor teratogen effekt = histogenese, og sidst falder følsomheden langsommere men har betydning for funktionsudvikling!
Organogenese: Rotter: Dag 6.-15., Mus: Dag 6.-12., Kanin: Dag 6.-18., Menneske: 3. uge til 3. måned
Teratogene effekter af organogenese påvirkning kan være skelet abnormaliteter - delvis fusionerede ribben/fortykkede/bøjede.
Ex. teratogen effekt med Thalomid
Beroligende og kvalmestillende middel anvendt i 1950’erne. Forbudt fra 1962
Stærk teratogen effekt mellem dag 35. og 50. i graviditeten (DNA skade)
Mindst 10.000 børn i 46 lande blev født med misdannelser
Forårsager korte, luffelignende arme og ben (fokomeli, “sællemmer”)
Teratogen dosis:
Rotter og mus: 4000mg/kg
Mennesker: 0.5-1.0 mg/kg
Kaniner: 2.5 mg/kg fra dag 12
Kan anvendes som positiv kontrol i teratogenicitets tests
Carcinogenicitets test
Test for carcinogenicitet
Formål: At vurdere et stofs mulighed for at forårsage tumorer
Rotte carcinogenicitets test:
Mus, rotte - op til 2 år. 3 forskellige koncentrationer. En administrations rute. Begge køn
End points:
Biokemisk blodprofil
Makroskopiske forandringer
Histologi af mindst 40 forskellige typer væv og organer
Mus kan udvikle spontane lever og lunge tumorer i visse linjer
Hunde: Kroniske studier op til 7 år pga. længere levetid
