M6 Basal toxikologi Flashcards
Kroppens væskebalance reguleres i høj grad af nyrerne, som filtrerer blodet og styrer udskillelsen af overskydende væske gennem urinen.
Vandindtag mindre end 1 liter pr. time: Hvis en person indtager mindre end 1 liter vand pr. time, vil kroppen forsøge at kompensere for dette ved at bevare så meget væske som muligt.
Vandindtag større end 1 liter pr. time: Hvis vandindtaget overstiger 1 liter pr. time, vil det medføre en stigning i væskemængden i blodbanen. Dette fører til en lavere koncentration af natriumklorid (NaCl) i blodet, hvilket igen resulterer i, at væske siver ud fra blodbanen og ind i cellerne.
Celler i CNS opsvulmer og klemmes pga begrænset plads → CNS symptomer som koma og død.
Man kan derfor dø af at drikke for meget vand.
Et stofs toksicitet afhænger primært af eksponeringsniveauet samt dets kemiske egenskaber, koncentration, varighed af eksponering og måden, hvorpå det indtages. Individuelle faktorer som alder, helbred og genetisk disposition kan også spille en rolle.
Toksikokinetik:
Toksikokinetik fokuserer på tilstedeværelsen af giftstoffer i forskellige medier som luft, vand, mad osv. og mekanismer, der påvirker optagelse, distribution, metabolisme og udskillelse af disse toksiner.
Faktorer der påvirker TK: Distribution, dosis, doseringshyppighed, species, alder, køn, sygdomsstatus, næringsstatus, fysiokemiske egenskaber, administrationsvej, udskillelse, tidligerer eksponering.
For at bestemme kinetikken udføres seriel aflivning, hvor koncentrationen af teststof og metabolitter måles i blod/væv. Ekskretion af teststof + metabolitter måles via metabolisme kamre af opsamlet urin/fæces/udånding.
Toksikokinetik er kompleks af:
* Absorption, mængde og hastighed afhænger absorptionsvej
* (oral, inhalering, dermal, injektion)
* Distribution i kroppen (eksponeringslængde og intensitet)
* Metabolisme (evt. toksiske metabolitter)
* Elimineringshastighed, T½ (urin, fæces, udånding)
Toksiko-dynamik:
Toksiko-dynamik handler om dosis på flere niveauer, lige fra kritisk makromolekylær til væv til hele kroppen. Det undersøger også mekanismer, der fører til ændringer i funktioner og struktur, samt akutte og kroniske respons, herunder funktionelle effekter og risiko for kræft.
Opdeles i systemisk og lokal effekt
Systemisk effekt
* effekt andre steder end der hvor initiel eksponering og absorption har fundet sted
* stofferne absorberes og fordeles så hele organismen påvirke (organspecificitet)
Lokal effekt: Overskride beskyttende barriere
* Diffusion (f.eks. indånding af nitrøse gasser)
* Ødelægge barrieren (stærke syrer/baser)
Hvad er afgørende for om et fremmedstof når et påvirkeligt område i en tilstrækkelig høj koncentration I tilstrækkelig lang tid?
For at et fremmedstof når et påvirkeligt område i tilstrækkelig høj koncentration i tilstrækkelig lang tid er det afgørende, at det bliver optaget, distribueret, metaboliseret, og udskilt korrekt i kroppen, samt at eksponeringen varer længe nok og i tilstrækkelig høj koncentration.
Hvad er forskellen på PK/PD og TK/TD?
PK/PD (Pharmacokinetics/Pharmacodynamics) fokuserer på, hvordan kroppen påvirker et lægemiddel og hvordan lægemidlet påvirker kroppen. TK/TD (Toxicokinetics/Toxicodynamics) handler om, hvordan kroppen påvirker et giftstof og hvordan giftstoffet påvirker kroppen. Begge sæt af begreber er vigtige for at forstå virkningen af stoffer på kroppen, enten terapeutiske eller toksiske.
Risikovurdering:
Risikovurdering dækker alle disse områder og er en bred analyse af toksicitet og de potentielle sundhedsmæssige risici, der er forbundet med eksponering for forskellige stoffer og miljøforhold.
LD LDn Letal tærskelværdi
LD: Lethal dose
LDn: LDn lethal dose for n% af populationen. n% af populationen. Eks. LD50 = lethal dose for 50% af populationen
LD50 bruges til at vurdere stoffers giftighed. I akutte toksicitetstest bestemmes den dosis af stof, der skal indgives til en gruppe dyr, for at halvdelen af dyr dør. Det er dog meget uetisk. Idag anvendes primært Fixed Dose, der bruger få dyr.
Letal tærskelværdi:
Letal tærskelværdi (nedre dosisgrænse, inden letal effekt). Ofte anvendes andre responsvariable for effekt i stedet for død f.eks. kliniske tegn
Ex. 2 stoffer A og B kan have samme LD50 men forskellig letal tærskelværdi - hvilket er mest toxisk? Det er stof A med den laveste letale tærskelværdi. Stof B har det smalleste terapeutiske index.
Et stof skal klassificeres med GHS via akut toksicitetstest. Idag anvendes Fixed dose studer istedet for LD50 for at minimerer brugen af forsøgsdur. Formålet med Fixed dose er at etablerer MTD maximum tolerated dosis.
TD TDn, ED EDn TI Hazard, Risk, NOEL NOAEL, LOAEL, ADI, MRL
TD/TDn: Toxic dose
ED/EDn: Effective dose
TI Therapeutisk index TD50/ED50
Terapeutisk index IT er forholdet mellem det terpaitiske og toksiske dosis TD50 el. letale dosis LD50. Der kan enten være en 1) Safety based TI LD50/ED50 for sikkerhed, eller 2) efficacy based TI TD50/ED50.
Hazard: ”Farlighed”. Potentialet for at en agens forårsager en uønsket effekt
Risk: Sandsynlighed for en agens forårsager en uønsket effekt, ved en specifik eksponeringsintensitet og varighed
NOEL: No Observed Effect Level den højeste dosis/koncentration af et stof, hvor der ikke observeres nogen effekt
NOAEL: No Observed Adverse Effect Level den højeste dosis/koncentration af et stof, hvor der ikke oberserveres nogen uønsket effekt
LOAEL: Low Observed Adverse Effect Level den højeste dosis/koncentration af et stof hvor der observeres en lav uønsket effekt
ADI:
Acceptabel daglig indtagelse (fødevarer, pesticider). NOAEL er basis for at kunne beregne Acceptable Daily intake (ADI), som er vigtig for fastsættelse af MRL værdier og tilbageholdelsestider
MRL: Maximum residue level (maksimal grænseværdi)
Benchmark dose:
Benchmark Dose er et statistisk modelleret estimat af NOAEL som bruges indenfor fødevaresikkerhed til beregning af tilbageholdelsestid
Mutagen vs carcinogen
Mutagener:
Et mutagen er et biologisk, fysisk eller kemisk agens der medfører permanente ændringer i genom. De fleste mutagener er også carcinogene. Ex. inkluderer radioaktive stoffer, røngtenstråling, UV stråling, kemikalier, metaller, virus.
Carcinogener:
Et carcinogen er et agens der medfører cancer. Fører enten til elelr fremmer udvikling af cancer. Ikke alle carcinogene er mutagene. Ex. Rygning, stråling, patogener, miljøpåvirkninger, kost. Medfører tumordannelse el. cancer.
🌸In vitro test
In silico studier: Structure-activity analyses fra store databaser
In vitro studier: Cellekultur, Vævskultur, Organ studier
In vitro toksikologiske test:
Fordele:
・ Billig, Relativt simple, Kontrolleret miljø, Ingen/færre brug af forsøgsdyr (3R)
Ulemper:
・Mangler systemisk effekt, herunder metabolisme
・Mangler celle-til-celle interaktioner
・Kræver sterilt miljø (Mycoplasma kontaminering)
・Ekstrapolering fra in vitro til in vivo
Cellekulturer (vævsdyrkning) dannes ved permanente cellelinjer ex. HEK293 (Human Embryonic Kidney cells), CHO cells (Chinese Hamster Ovary cells), HeLa cells (Henrietta Lacks*).
Fra primære cellekulturer tages vævbiopsi, hvilket frigiver specifikke celler og man sortere celler via FACS fluorescense activated cell sorting.
Organkultur eks. Langendorf-hjertemodel
Stamcellekulturer eks. hiPSCs (human induced pluripotent stem cells
End-points i in vitro toxikologiske test: I toksikologiske in vitro test refererer et “endpoint” til et specifikt mål eller en målbar biologisk effekt, som eksperimentet sigter mod at observere eller kvantificere.
Celleviabilitet: Bestemmer antal celler i et tællekammer (celler/ml) evt. tælles antal celler som optager farven trypanblå (døde).
Membranlækage: frigivelse af makromolekyler fra cellen til vækstmedie pga tidligere membranskader
Cellevækst og proliferation
Cellemorfologi
Metaboliske assays
Genekspression
Krav til in vitro endpoints
・Skal udvise dosis-respons forhold
・Skal afspejle in vivo effekt (eks. en specifik valideret mekanisme)
・Skal være målbare og reproducerbare (eks. luminescens)
・Skal have intern kontrol
In vitro toksikologiske test: Er ofte simulerede levermetabolismer i et kammer ved diffusion af toxiner og metabolitter til målceller. Laves i en petriskål der celler et cellemonolag med vækstmedie. Toxiner tilsættes cellekulturen med hepatocytter og microsomer. Via microporøse barrirere tillades passage af toxiner som diffunderer mod targetceller.
Opsummering af in vitro test:
* In vitro tests (med stigende kompleksitet) bruges inden in vivo tests for at undgå at teste stoffer med høj toksicitet
* Undgå unødig lidelse
* Ingen (færre) brug af forsøgsdyr (3R)
* Udviklingen af in vitro assays er dynamisk
Udfordringer: * Validering af in vitro assays og * Ekstrapolering mellem in vitro og in vivo
* In vivo tests vurderes stadig uerstattelige
🌸In vivo studier
Formål med in vivo studier: Etablere dosis-respons forhold og bestemme NOAEL
In vivo toksiko dynamik studie - etablerer doseresponskurven m. Endpoints: For at definere et stofs toksicitet el. dets kliniske effekt anvender vi endpoints.
End-points: en hændelse eller et resultat, der kan måles objektivt for at afgøre, om interventionen, der undersøges, er gavnlig (kliniske studie) eller toksisk (toksikologiske studier)
End-points er en sammenfatning af kliniske og terminale observationer. Ved et in vivo toksikodynamisk studie, hvor man etablerer dose-responsforhold, undersøger man virkningerne af et stof i levende organismer. De endpoints, der vurderes, inkluderer biokemiske analyser, organers tilstand, histologi, organsystemer og kliniske observationer.
Kliniske observationer: Nedstemthed, ændring i biokemisk profil
Terminal observation: Specifik organ patologi, celleforandringer
NOAEL/LOAEL:
Baseret på observerede endpoints defineres en dosis, der ikke giver adverse effekter (NOAEL) el. lave adverse effekter LOAEL. NOAEL/LOAEL kan kun være én af de anvendte doser i studiet.
Hvad forstås der ved NOAEL?
NOAEL etableres i in vivo toksikologiske studier. Det er basis for at beregne FIH First in human dose.
I in vivo test er det vigtigt at tage højde for
* Arts selektion: Ofte test i både gnavere (mus/rotte) og ikke-gnavere (hund/gris/abe) – typisk raske dyr
* ‘Guide for the care and use of laboratory animals’ (ILAR, 2010)
* 3R: Reduction, refinement, replacement
* Good laboratory practice (GLP) – sikrer kvalitet og reproducerbarhed af data (krav)
* Study director
* Quality assurance (QA) unit
* Documented standard operating procedures (SOPs)
* Written protocol
* Final report with QA statement
* GLP not required by Food and Drug Administration (FDA) on
domestic livestock studies.
* CRO = Contract Research Organisations
* Most GLP in vivo tox studies are performed at CROs
In vivo toksikologiske tests: Valg af administrationsvej – relevante eksponeringsveje
Akutte studier (MTD etablering)
“Single dose” akut toksicitet (OECD 401, udgået):
Undersøger akut toksicitet, ved ‘single dose’. Formål: Etablere LD50/tydelig toksicitet som kan bruges til at klassificere et stof i GHS* og/eller til efterfølgende subkronisk og kronisk toxicitetstests
Max. dosis i Gnavere: 2000 mg/kg/d, Andre dyr: 1000 mg/kg/d, Dosis ofte med 50 X klinisk dosis
Antal dyr: mindst 10 mus eller 5 rotter pr. gruppe. Begge køn
Observation 24 timer – 14 dage
Akut “fixed dose” toksicitet (OECD 420):
Formål: Etablere en Maximum tolerated dosis (MTD), ikke LD50
Initial dosis er udvalgt til at give tegn på toksicitet, men uden at føre til alvorlig toksiske effekter eller mortalitet.
Dosis: 5, 50, 300 eller 2000 mg/kg/d. Efterfølgende doser er højere eller lavere end initial dosis
Dyr: rotte, (mus), Køn: hunner da de er mere sensitive, (han). Antal dyr: 5/dosis. Observation: 24 t – 14 d
Et studie skal fastsætte maksimal tolerabel dosis MTD i rotter forud for det subkroniske toksikologi studie med en ny lægemiddelkandidat.
Subkroniske studier
Subkroniske studier (repeated dose) 90 dage.
Overvejelser til subkroniske og kroniske studier:
Administrationsvej, hyppighed, dosis response, tidsprøve-tagning, MTD, kendskab til virkningsmekanismen, multiple aflivninger ved forskellige doseringslængder, reversibilitet (inkl. recovery dyr) og guidelines for forskellige typer toksicitet (ex. genotox/reprotox/carcinogenicitet), samt Endpoints og biomarkører.
Dosisvalg og studiedesign: Dosisvalg er vigtig når man vælger repeated dose studier.
* Høj dosis kan være bestemt ud fra akut tox studie hvor den maksimalt tolereret dosis bestemmes (MTD), * Max. tolerated dose (MTD), * Max. feasible dose (MFD), * ICH M3, Mean exposure margin 50x clinical exposure (50 x den dosis som skal anvendes i de kliniske forsøg), * Lav dosis i terapeutisk relevant range
Subkroniske studier følger OECD guidelines 408 og 409:
* Mindst 10 af hvert køn pr gruppe (gnavere), mindst 4 af hvert køn (ikke-gnavere)
* Mindst 3 doseringsniveauer (evt. Baseret på tidligere tests)
* Rask kontrolgruppe (ubehandlet eller vehicle)
* Doseringshyppighed: dgl. 7 dage om ugen i min 90 dage (ændringer kræver argumentation)
* Observation: 90 dage
* Endpoint: Kliniske og terminale observationer (mere om dette senere)
Kroniske
Kroniske studier 6-24 mdr.
Overvejelser til subkroniske og kroniske studier:
Administrationsvej, hyppighed, dosis response, tidsprøve-tagning, MTD, kendskab til virkningsmekanismen, multiple aflivninger ved forskellige doseringslængder, reversibilitet (inkl. recovery dyr) og guidelines for forskellige typer toksicitet (ex. genotox/reprotox/carcinogenicitet), samt Endpoints og biomarkører.
Dosisvalg og studiedesign: Dosisvalg er vigtig når man vælger repeated dose studier.
* Høj dosis kan være bestemt ud fra akut tox studie hvor den maksimalt tolereret dosis bestemmes (MTD), * Max. tolerated dose (MTD), * Max. feasible dose (MFD), * ICH M3, Mean exposure margin 50x clinical exposure (50 x den dosis som skal anvendes i de kliniske forsøg), * Lav dosis i terapeutisk relevant range
Kroniske studier følger OECD guidelines 452:
* Mindst 20 af hvert køn pr dosis gruppe (gnavere), mindst 4 af hvert køn pr dosis gruppe (ikke-gnavere)
* Mindst 3 doseringsniveauer (baseret på tidligere tests), maks dose 1000 mg/kg bw/dag
* Doseringshyppighed: dgl. 7 dage om ugen ofte i 12 måneder, men afhænger af studiets varighed
* Endpoint: Kliniske og terminale observationer (mere om dette senere)
End-points til in vivo toksikologiske test med gentagne doseringer:
Kliniske obs: Kropsvægt, fødeindtag, Ophthalmoscopy, ECG, Haematology, Klinisk kemi, Urinanalyse, Toxicokinetik, Antistof Analyse
Terminale obs: Obduktion, Makroskopiske fund, organvægte, hisopatologi af 50 organer/væv.
Studie konklusion: Alle data indsamles til NOAEL som er den dosis hvor man ikke observerer nogle adverse effekts.
Safety margin
Startdosis til human afprøvnign estimeres udfra NOAEL korrigeret med HED (human equivalent dose) og divideret med en safety factor SF. SF mellem dyr og mennesker er ofte 10 (interspecies), SF individual variation ofte 10 (intraspecies).
Dosis-respons og etablering af NOAEL fra in vivo:
POD=point of departure, etableret fra eksperimentielt data for at finde et sikker dosis niveau
RfD= Reference dose
BMD = Benchmark Dose (estimat af NOAEL) som bruges i fødevaresikkerhed
NOAEL kan kun være én af de testede doser, derfor en fordel med BMD
Varighed af repeat dose toksikologisk studie til support af humane kliniske trials (ICHM3) og behandling af dyr
- Hvor lang tid skal man mindst have doseret forsøgsdyr forud for 28 dages behandling i en human klinisk afprøvning af et nyt lægemiddel? - 28 dage.
- Hvor lang tid skal man have doseret hunde med et nyt lægemiddel, der skal registreres til dosering af hunde i maksimalt 5 dage? - 15 dage.
Pivotal margin of safety study in target animal with doses 0X, 1X, 3X and 5X the therapeutical dose administered for 3X the intended duration.
Test for genotoksicitet
Formålet med en genotoksicitet test er at vurdere mulig toksisk effekt på genetisk materiale in vitro og in vivo. Undersøges typisk via punktmutationer og kromosomforandringer, herunder brud på DNA.
Standard laves følgende in vitro test.
enten Ames eller Mikronukleus test
Ames test (in vitro genotoksicitets-test)
Ames test OECD TG 471: Undersøger om mutagen kan reversere mutationen i Salmonella Typhimurium, hvilket medfører aminosyresyntese og reverserer mutationen. Laves på bakterier.
I en Ames test (test for genotoksicitet) kan man undersøge om et stof er mutagent, samt eksponere det potentielle mutagene stof for leverekstrakt, for at se om der dannes metabolitter der kan være genotoksiske.
Man benytter Salmonella typhimurium, som har en punktmutation, der medfører at de ikke kan syntetisere aminosyren histidin. S. typhymurium kan derfor ikke lave proteiner, og dermed vil der ikke være vækst. Man udsår disse S. typhimurium på et histidinfattigt medie sammen med det stof, man ønsker at undersøge for at være genotoksisk/mutagent. Hvis stoffet er mutagent, vil det revertere bakteriernes mutation, så de vil begynde at syntetisere histidin og der vil ske vækst. Det er vigtigt at foretage testen både med og uden leverekstrakt, for at undersøge om det er “parent compound” eller metabolitter, der er genotoksisk. Fordi de fleste mutagene og toksiske stoffer først bliver aktive efter metabolisering (ex. oxidation eller konjugation) simuleres der en levermetabolisme, under Ames-test, ved at tilføje leverekstrakter (lever-cellekulturer med tilhørende enzymsystemer), der kan metabolisere det mutagene stof til en evt. toxisk metabolit og deraf mimikere levermetabolismen.
Mikro nukleus test
Mikronukleus test OECD TG 487: Undersøger mammale (rotter/humane) cellekulturer for eksponering af teststof, og derefter undersøges der for mikronuklei og kromosomskade.
Mikronukleus test tester for genotoksicitet og formålet er at vurdere mulig toksisk effekt på genetisk materiale når hele organismen eksponeres (tager højde for ADME).
Ofte anvendte in vivo test:
1) Erythrocyt-mikronukleus test OECD TG 474: som tester et stofs potentiale til at inducerer kromosomskade (dannelse af micronucleus). Immature erythrocytter i knoglemarven har en kerne i cytoplasma. Ved DNA skade af nuklerede erythrocytter kan der dannes kromatinrester som benævnes mikronukleus. Erythrocytter afgiver efter deres sidste deling deres kerne. Af ukendte årsager forsvinder mikronukleus ikke i de modne erythrocytter og kan derfor bruges som indikation på genotoksicitet.
Forløb: 1) mus eksponeres, 2) eutanasi, 3) benmarv fra lårknogle udsuges, 4) udstrygningspræperat fremstilles og farves 5) Polykromatiske erythrocytter analyseres for mikronuklei.
2) Knoglemarvs micronucleus test (OECD TG 475), som tester et stofs potentiale til at inducerer kromosomforandringer i testdyr
3) Alkalisk comet assay (OECD TG 489), til identifikation af brud på DNA streng, ofte anvendes gnavere der behandles med teststof, der udtages enkeltceller fra relevant væv og DNA isoleres, DNA eksponeres for alkalisk miljø hvorved det udfoldes, afbrækkede DNA stykker kan derefter detekteres vha. elektroforese
Toksikokinetiske studer
In vivo studier:
Varighed
an være nødvendigt at ekstrapolere mellem arter
In vivo studier opdeles i 4 kategorier:
akut: ofte <24 timer
subakut: Ofte 2-4 uger
subkronisk: Ofte 1-3 måneder
kroniske: Ofte > 3 måneder; ofte 2 år
Kan også beskrives med antal dage f.eks. et 90 dages studie
Reproduktions toksikologiske test
Formål: At vurderer mulig tocisk effekt på reproduktionsorganer, både funktionelle og strukturelle effekter (han/hun). Ofte anvendes rotter og mus, og man laver typisk multigenerationsstudier (min. 2. gen).
Effekt: Premating, matingGD0, implantation GD6, end of organogenesis GD17, C-section GD20, Birth GD21, weaning LD21.
Ex. bruges in vitro forsøg til reproduktionstoksikologi ved
1) Pyrethroider som anvendes som pesiticer ex. deltamethrin er under mistanke for at have effekt på hanlig kønsudvikling.
2) Test for stoffer med androgen effekt. Hæmning af androgen receptor er relateret til nedsat fertilitet hos hankøn. Assayet bruges til at teste pesiticer (pyrehtroider). CHO celler transfekteret med en human androgen recepto hAR som er en transkriptionsfkator. Ved ligangsbinding transkriptere den hAR rapportergenet luciferace hvis produkt kan måles med et luminometer.
Teratogenicitets test
Formål: At vurdere mulig toksisk effekt på foster (fra zygote til neonatal)
Både funktionelle og strukturelle effekter. Fase med organogenese er afgørende.
Art: Oftest rotter, mus og kaniner (non-rodent, thalidomid
Stoffer betegnes teratogene på baggrund af: Strukturelle deformiteter, Vækst hæmning, Foster død
Stoffer betegnes som teratogene og/eller føtotoksiske.
Når man tester for teratogen effekt testes følsomhedden overfor teratogen effekt over tid.
Befrugtning og implementation påvirkes typisk ret lidt, men i takt med embryoudvikling stiger følsomhed for teratogen effekt markant = Organogenese!
I skiftet mellem embryo til foetus falder følsomheden overfor teratogen effekt = histogenese, og sidst falder følsomheden langsommere men har betydning for funktionsudvikling!
Organogenese: Rotter: Dag 6.-15., Mus: Dag 6.-12., Kanin: Dag 6.-18., Menneske: 3. uge til 3. måned
Teratogene effekter af organogenese påvirkning kan være skelet abnormaliteter - delvis fusionerede ribben/fortykkede/bøjede.
Ex. teratogen effekt med Thalomid
Beroligende og kvalmestillende middel anvendt i 1950’erne. Forbudt fra 1962
Stærk teratogen effekt mellem dag 35. og 50. i graviditeten (DNA skade)
Mindst 10.000 børn i 46 lande blev født med misdannelser
Forårsager korte, luffelignende arme og ben (fokomeli, “sællemmer”)
Teratogen dosis:
Rotter og mus: 4000mg/kg
Mennesker: 0.5-1.0 mg/kg
Kaniner: 2.5 mg/kg fra dag 12
Kan anvendes som positiv kontrol i teratogenicitets tests
Carcinogenicitets test
Test for carcinogenicitet
Formål: At vurdere et stofs mulighed for at forårsage tumorer
Rotte carcinogenicitets test:
Mus, rotte - op til 2 år. 3 forskellige koncentrationer. En administrations rute. Begge køn
End points:
Biokemisk blodprofil
Makroskopiske forandringer
Histologi af mindst 40 forskellige typer væv og organer
Mus kan udvikle spontane lever og lunge tumorer i visse linjer
Hunde: Kroniske studier op til 7 år pga. længere levetid
Kutane tests, neurotoksicitets- og immunotoksicitets tests
Kutane test
Formål: At vurdere mulig toksisk effekt på hud
Lokal irritation, men også systemisk og klinisk vurdering
Arter: albino kaniner, men også albino rotter, marsvin, mus og minigrise
Neurotoksicitets test
Formål: At vurdere et stofs effekt på CNS og ANS. Ofte anvendes gnavere
Effekter som vurderes:
Kliniske tegn: bevægelse herunder koordinering af bevægelser, reflekser, paralyse, tremor, indlæring og hukommelse
Neurokemiske ændringer
Neurofysiologiske effekter
Neuroanatomiske effekter
Test for immuntoksicitet
Formål: At vurdere et stofs effekt på immunsystemet. Ofte gnavere, især mus
Effekter:
Relevante celler: ændringer i antal, morfologi og/eller viabilitet
Organer: Vægt af lymfoide organer (milt og thymus)
Immunmekanismer: Immun respons
- Kende til brugen af OECD og ICH guidelines.
vurdere deres potentielle risici for mennesker og miljøet. Disse retningslinjer omfatter blandt andet krav til testmetoder, dataindsamling og rapportering for at sikre en ensartet tilgang til vurdering af kemikalier på tværs af lande og organisationer.
ICH retningslinjerne er mere specifikke for lægemidler og fokuserer på vurdering af lægemidlers sikkerhed, herunder toksikologiske vurderinger, som er afgørende for at sikre, at lægemidler er sikre at bruge for mennesker.
ICH guidelines
Varighed af repeat dose toksikologisk studie til support af humane kliniske trials (ICHM3) og behandling af dyr.
1. Hvor lang tid skal man mindst have doseret forsøgsdyr forud for 28 dages behandling i en human klinisk afprøvning af et nyt lægemiddel?
2. Hvor lang tid skal man have doseret hunde med et nyt lægemiddel, der skal registreres til dosering af hunde i maksimalt 5 dage?
Svar: 1) 28 dage og 2) 15 dage. Target animal safety studies (VICH 2017). Pivotal margin of safety study in target animal with doses 0X, 1X, 3X and 5X the therapeutical dose administered for 3X the intended duration.
Toksikologiske risikovurderinger
Hvorfra bliver vi eksponeret?
Hvordan bliver vi eksponeret? * akkumulerer det eks. i fedtvæv
Hvor meget bliver vi eksponeret? * noget vi spiser? / er den mængde vi eksponeres for toksisk?
Sundhedsskadeligt?
Risikovurdering af lægemidler, lægemiddelrester i fødevarer, kemikalier i miljøet etc
Toksikologiske begreber
Hazard: ”Farlighed”. Potentialet for at en agens forårsager en uønsket effekt
Risk: Sandsynlighed for en agens forårsager en uønsket effekt, ved en specifik eksponeringsintensitet og varighed
Risikovurdering: en proces, der samler fare-identifikation, effektvurdering, eksponeringsvurdering og risikobeskrivelse
Risk = Hazard x Exposure
Fokus idag sker via eksponering via fødevarer. Eksempel på eksponeringer human biomonitoring for(4) europe HBM4EU der har stort fokus på PFOS (stof gruppe kemiske flourstoffer).
Flow diagram ved toksikologisk risikovurdering:
Risk communication -
Risk research
Risk assessment: 1) hazard identification, 2) exposure, dose and response assessment, 3) exposure assessment, 4) Risk characterisation, 5) identification of research needs.
Risk management decisions.
Forskel på akut vs kronisk toksicitet
Akut toksisitet:
* Enkelt indtag – effekt indenfor 24 timer
* Hypersensitivitet – fødevarer med rester af antibiotika – allergiske reaktioner såsom hævelser i huden, shock, astma, feber. Eks Kloramfenikol, penicilliner og levamisol.
* Farmakologiske effekter – akutte effekter, typisk overdreven farmakology ex clenbuterol (beta- agonist) brugt som vækstfremmer i kvæg/svin ved doser 10x farmakologisk dosis der akkumuleres i lever, nyre, lunge og til dels muskler
* Teratogene effekter- sjældne tilfælde hvor fosterskade kan forekomme hvis moder indtager stoffer i en bestemt graviditetsperiode (organogenesen)
Kronisk toksicitet
* Carcinogen (eks. nitrit)
* Antimikrobielle effekter (Allergiske reaktioner el. Multiresistente bakterier)
* Hormonelle effekter: Binding til hormon receptorer med en række effekter ved fysiologiske konc inkl. cancer (eks. androgene eller østrogene effekter)
Minimumskrav til toksikologiske test fra myndigheder kan omfatte:
1. Flere forskellige genotoksiske tests (Ames test, in vitro /in vivo micronucleus test)
2. 90 dage p.o. toksikologisk studie (gnaver og ikke gnaver)
3. To-generations reproduktions toksikologisk studie
4. Tester parent drug substance og hvis nødvendigt aktive metabolite(r) og excipient(er)
Yderligere krav kan stilles: Teratogenicitets test i flere arter f.eks. hvis stoffet har strukturel lighed med et andet stof, som har vist sig at være teratogent i tidligere tests
Bestemte guidelines skal følges (OECD).
Tilbageholdelsestid
Den nødvendige tidsperiode der skal gå mellem seneste administration af et veterinært lægemiddel til et dyr og produktion af fødevarer fra dette dyr (f.eks. Mælk, æg, muskelvæv, fedtvæv osv).
Hvad bør man kende til for at estimere tilbageholdelsestid?
Distribution, proteinbinding, halveringstid, metabolisme, toksicitet for mennesker, hvor lidt er accetabelt i mennesker og kan godkendes til konsum? Metabolitter og aktive metabolitter
POD RfD og BMD
POD = point of departure, etableret fra eksperimentielt data for at finde et sikker dosis niveau
RfD = Reference dose
BMD = Benchmark Dose (estimat af NOAEL) som bruges i fødevaresikkerhed. NOAEL kan kun være én af de testede doser, hvorimod en BMD bruger alle data fra de toksikologiske tests og bestemmes vha. en fittet dosis-respons kurve.
Mere om BMD senere.
Acceptabel daglig indtagelse (ADI)
- ADI er et estimat af mængden af et stof i fødevarer eller drikkevand der kan indtages dagligt i løbet af et helt liv uden at udgøre en mærkbar risiko for helbredet
- ADI gælder for kemiske stoffer som: fødevaretilsætningsstoffer, pesticider, veterinære lægemidler.
- Angives ofte i mg/kg bw/dag
- ADI beregnes ud fra NOAEL eller en Benchmark Dose (BMD) og en safety factor: ADI = NOAEL/Safety factor SF
SF: 10 – 1000
SF fastsættes ofte til 100 (10x10): 10 ved individuel variation og 10 ved extrapolation fra dyr til mennesker.
SF justerer for individuel variation, artsforskelle mm
Gennemgang af toksikologiske principper ift. fødevaresikkerhed
Toksikologistudier ex. akut/subakut/kronisk/genotoksisk etc → NOAEL.
NOAEL → Safetyfactor → ADI → kliniske studier af restkonc. og beregning af TMDI (foodbasket) → TMDI → TK studier af rest konc. og deraf → MRL → tid for nedbrydning → tilbageholdelses tid.
Maximal grænseværdi MRL
MRL er et udtryk for, hvor meget af det pågældende stof (eks. medicin, pesticider, kemikaler), der maksimalt må findes i fødevarerne. MRL er ofte angivet i μg/kg. Krav om at der skal være fastsat en MRL værdi for aktive stoffer, som indgår i lægemidler til produktionsdyr. Dog findes der stoffer, hvor det er vurderet, at det ikke er nødvendigt at have en grænseværdi (eks. ”ikke-kemisk lignende stoffer som eks. fodderstoffer, celler, lipider, aminosyre). Case-by case vurdering
Fødevarestyrelsen fastsætter regler for tilbageholdelsestider. Forbud mod profylaktisk antibiotika behandling – risiko for multiresistente bakterier. Kun individuel behandling af produktionsdyr i EU
EU Kommissionens forordning 37/2010: MRL for lægemiddelrester og forbudte stoffer er angivet:
* Tabel 1 : Stoffer, som må indgå i lægemidler til produktionsdyr, dvs. både de stoffer, der har en MRL, og de stoffer, hvor det ikke er nødvendigt.
* Tabel 2: Forbudte stoffer, altså stoffer, der ikke må indgives til fødevareproducerende dyr.
Ex. Chloramphenicol, der giver aplastisk anæmi og carcinogenitet.
Hvordan bestemmes koncentrationen af stoffet i en fødevarer?
Via EU - Regulation (EC) No 470/2009. Farmakokinetikstudier i forsøgsdyr og produktionsdyr hvor restkoncentrationer bestemmes over tid for parent drug og dets metabolitter i væv og organer (især target væv i.e. muskel, lever, nyre) via Radioaktivt mærket stof.
Derefter dannes en dose-responskurve for forskellige væv.
- Hvor meget kød/mælk/æg etc. indtager en gennemsnitlig person dagligt og hvor meget af det pågældende stof konsumeres?
Beregning af teoretisk maksimal daglig indtagelse TMDI:
For at estimere MRL bliver vi nødt til at have en idé om hvor meget af et stof og dets metabolitter en person samlet set vil indtage pr. dag
* Koncentrationerne fra farmakokinetikstudierne anvendes
* Estimering af residue intake eller TMDI for en person på 60 kg
* Estimering ud fra en ”Standard food basket”
L=lever K=nyre F=fedt M=muskel
Forventet daglig fødeindtagelse for et menneske på 60 kg/dag
Derefter regnes Residure intake:
RI = ClFl/Rl + CkFk/Rk + Cm*Fm/Rm. hvor C er koncentration af maker residuer i ug/kg, F = føde indtaget, og R = ratio marker residue vs. total residue.
Estimering af MRL opsummering:
* Restkoncentration i væv bestemmes ud fra farmakokinetiske studier (valideret analysemetoder, radioaktivt mærket stof)
* MRL bestemmes ud fra TDMI og ADI.
* MRL er en stofkoncentration der ligger under det teoretisk maksimal daglig indtagelse (TMDI) der igen skal ligge under det acceptable daglige indtag (ADI)
- Hvor lang tid efter administration af stoffet skal der gå før koncentrationen af stoffet I kød/mælk er lavt nok til at det sikkert kan anvendes til konsum?
Tilbageholdelsestider
Tilbageholdelsestider
* Den nødvendige tidsperiode der skal gå mellem seneste administration af et veterinært lægemiddel til et dyr og
produktion af fødevarer fra dette dyr (f.eks. Mælk, æg, muskelvæv, fedtvæv osv).
* Sikrer at fødevarer ikke indeholder residues fra lægemidler over MRL værdien
* Det totale teoretisk maksimal daglig indtagelse beregnes for hver tidsmåling så tidspunktet hvor TMDI<ADI etableres.
* Dette tidspunkt bruges til at fastsætte tilbageholdelsestid.
* Man vælger typisk data fra det væv der giver den længste tilbageholdelsestid
Estimering af tilbageholdelsestid
* Tilbageholdelsestid bestemmes på baggrund af:
* MRL (μg/kg)
* Restkoncentrationer i væv
* Restkoncentrationer i lever, nyre etc. er forskellig i forhold til tiden
* Man vælger typisk data fra det væv der giver den længste tilbageholdelsestid
MRL of tilbageholdelsestid - opsummering
Faktorer nødvendige for at estimere MRL
* Farmakodynamik studier
* Etablering af NOAEL eller BMD
* NOAEL fra den mest sensitive test fra den mest sensitive dyreart anvendes
* ADI (Acceptabel daglig indtagelse)
* Beregnet ud fra NOAEL eller en Benchmark dose/Safety Factor
Farmakokinetikstudier i forsøgs- og produktionsdyr
* Absorption (dosering, administration)
* Distribution (fordeling i kroppen)
* Metabolisme (især i fødevare relevant væv, mælk, æg, restkoncentrationer)
* Excretion (hvornår er et stof udskilt)
* Teoretisk maksimal daglig indtagelse (TMDI)
- Hvad er Benchmark Dose (BMD), hvordan bestemmes den og hvad bruges den til?
BMD er et statistisk modelleret estimat for NOAEL (no observed adverse effect level). BMD bruges til at beregne tilbageholdelsestid indenfor fødevaresikkerhed. Én af fordelene ved at bruge BMD frem for NOAEL, er at man kan estimere doser der ligger mellem de doser man har med i testen.
BMD bestemmes ved en fittet dosis-responskurve, som er baseret på alle de dosis-respons data man har.
Man anvender oftest den nedre grænse af 95%-konfidensintervallet for BMD, som kaldes BMDL (benchmark dose lower limit). Man anvender BMDL fordi man arbejder ud fra et forsigtighedsprincip.
BMR (Benchmark respons) er den acceptable respons indenfor konfidensintervallet. BMD er den værdi der giver BMR, dvs. giver det acceptable respons. Man fastsætter hvor højt et BMR man accepterer f.eks. BMR=5% som angives som BMD5 , eller BMR=10% som angives som BMD10. Det betyder at BMD10 er den dosis der giver en acceptabel stigning på 10% (BMR=10%).
BMD anvendes (eller NOAEL) sammen med SF (safety factor) til at estimere ADI (acceptabel daglig indtagelse). ADI bruges sammen med TMDI (teoretisk maksimal daglig indtagelse) til at fastlægge MRL (maksimale grænseværdi/maximal residue level), som bruges til at fastsætte tilbageholdelsestiden.
Fordele og ulemper ved BMD vs NOAEL
BMD fordele: Ikke begrænset til eksperimentielle doser, mindre afhængig af dose spacing, fleksibilitet til at determinere biologiske signifikante rates
BMD ulemper: Evne til at esteimere BMD begrænset når format of data presented, Time consuming, more complicated decision making process.
NOAEL fordele: Kan bruges når data ikke et brugbart til BMD modeling. Nemt at forstå. Er standard metode for at regne POD i lang tid.
NOAEL ulemper: Meget afhængig af dose selektion, Meget afhængig af sample sizes, accounter ikke for variabilitet og usikkerhed i studiet, dose respons information tages ikke med.
Hvor lang tid skal man mindst have doseret forsøgsdyr forud for 28 dages behandling i en human klinisk afprøvning af et nyt lægemiddel?
svar:
28 dage
Dose, Frequency, and Duration of Administration
In general, it is recommended that each group be treated for at least 3 times the proposed duration up to a maximum of 90 days. If short-term, intermittent use is intended, treatments should be administered 3 times at the recommended interval (for example, proposed weekly treatments should be administered for 3 consecutive weeks).
Hvor lang tid skal man have doseret hunde med et nyt lægemiddel,
der skal registreres til dosering af hunde i maksimalt 5 dage?
15 dage
Godkendelse af nye lægemidler til dyr
Discovery, preclinical lab development, clinical field trials, registration, manufacture and delivery
Tager normalt 8-10 år fra man opdager lægemiddelkandidater til det kan godkendes til praksis.
Organisationer og godkendelsesprocedure for nye lægemidler
Lægemiddelkanditater indsænkes til EMA el. lægemiddelstyrelsen som:
EMA/Lægemiddelstyrelsen: kan stille krav til hvilke toksikologiske test som skal gennemføres for at et lægemiddel vurderes som sikkert
Producenten opgave at: Udarbejder et forslag til hvilke tests som skal gennemføres
(CTD=common technical dokument) og gennemfører toksikologiske tests, hvorefter en ansøgning om godkendelse vurderes af EMA/lægemiddelstyrelsen
Procedurerne kan være:
1. Centrale: EMA er ansvarlige for evalueringen (*CVMP) – giver marketing autorisation i hele EU på baggrund af en ansøgning
2. Decentrale: Første behandling i et medlemsland efterfulgt af godkendelse i andre lande
3. Nationale (begrænset, veterinære lægemidler der kun skal godkendes i et enkelt land)
Pharmacovigilance
Pharmacovigilance betyder overvågning af lægemidlers sikkerhed
Overvågningen omfatter:
Indhentning af information om, hvor sikre lægemidlerne er at bruge
Identifikation og analyse af problemer og bivirkninger, som viser sig i behandlingen
Udarbejdelse af planer for, hvordan risici kan minimeres
Indberetning af bivirkninger til Lægemiddelstyrelsen
Overvågningen involverer både patienter, læger, dyrlæger, lægemiddelindustrien og myndighederne i ind- og udland
