M4S5 Comportement cinétique des enzymes Flashcards
• Comprendre et analyser la cinétique des enzymes • Citez les effecteurs physico-chimiques des réactions enzymatiques et leurs effets
Quelles sont les différentes étapes d’une réaction enzymatique ?
- Fixation
- Catalyse
- Libération des produits
E + S ⇄ ES ⇄ EP → E + P
A quoi correspond l’étape de fixation ?
L’enzyme (notée E) et ses substrats (notés S) s’associent au niveau du site actif.
Le complexe enzyme-substrat (noté ES) ainsi formé est stabilisé par des liaisons de faible énergie.
Cette étape de la réaction est réversible.
E + S ⇄ ES
A quoi correspond l’étape de catalyse ?
Le substrat est transformé en produit sous l’action de l’enzyme.
Cette étape peut être réversible, selon le type de réaction.
ES ⇄ EP
A quoi correspond l’étape de libération des produits ?
Les produits formés lors de la catalyse se dissocient de l’enzyme, celle-ci retrouve son état initial et peut effectuer une nouvelle catalyse.
Cette étape est irréversible.
EP → E + P
Pourquoi peut on simplifier la réaction enzymatique comme suit : E + S ⇄ ES → E + P ??
La vitesse de libération des produits est très supérieure à la vitesse de la catalyse.
Ainsi, la vitesse des deux réactions successives (catalyse et libération) correspond quasiment à la vitesse de la catalyse.
On peut donc regrouper ces deux réactions en une seule.
A quoi correspond la vitesse d’une réaction chimique ?
La quantité de substrat transformé (ou de produit formé) par unité de temps au cours de la réaction.
Elle est proportionnelle à la quantité de substrat présent et elle est caractérisée par une constante de vitesse notée k.
Une constante de vitesse est exprimée en nombre de réactions par unité de temps (unité : s-1 ou min-1).
Quelles sont les 3 constantes qui caractérisent une réaction enzymatique ?
k1 : constante de vitesse d’association (vitesse de formation du complexe ES)
k-1 : constante de vitesse de dissociation du complexe ES
k2 = kcat : constante catalytique (vitesse de formation du produit)
Qu’est ce que la constante de michaelis et menten ?
Km = (k-1 + k2)/k1
La constante de Michaelis, Km, est une constante propre à l’enzyme.
C’est une constante d’affinité qui donne une valeur de l’affinité de l’enzyme pour son substrat.
Le Km est inversement proportionnel à l’affinité.
Plus le Km est élevé, plus l’enzyme a une faible affinité pour le substrat (la dissociation du complexe ES est plus rapide que l’association).
À l’inverse, plus le Km est petit, plus l’affinité de l’enzyme pour le substrat est grande (l’association du complexe ES est plus rapide que la dissociation).
Comment calcule t-on la vitesse d’une réaction ?
Il est impossible d’étudier séparément la formation du complexe ES et la catalyse enzymatique.
On s’intéresse donc à la vitesse globale de la réaction, qui correspond à la quantité de produit formé par unité de temps, ou à la quantité de substrat transformé par unité de temps.
V = [S]/ t = [P]/ t
V : vitesse de réaction en mol.L-1.s-1
[S] : concentration de substrat transformé en mol.L-1
[P] : concentration de produit formé en mol.L-1
t : temps en s
Quelle type de courbe obtient on en reportant les résultats sur un graphique (produit /temps) en présence d’enzymes michaeliennes ?
On obtient une courbe de type hyperbolique (graphique produit/temps)
Comment détermine t-on la vitesse de réaction sur un graphique ?
Elle correspond au coefficient directeur de la tangente à temps donné.
Pour déterminer le coefficient directeur d’une droite, il suffit de lire les coordonnées de deux points A et B de la droite.
La valeur du coefficient directeur sobtient par l’expression :
a = (yb - ya) / (xb - xa)
Comment varie la vitesse de réaction au cours du temps ?
- la vitesse est maximale au début de la réaction ;
- elle diminue progressivement ;
- elle est nulle en fin de réaction (tangente horizontale).
En début de réaction, la vitesse est maximale car il y a une quantité importante de substrat.
Ensuite, au fur et à mesure de la disparition du substrat, la vitesse diminue et s’annule lorsque tout le substrat a été transformé en produit.
Qu’est ce que la vitesse initiale Vo ou Vi ?
La vitesse maximale en début de réaction. Elle est caractéristique d’une réaction donnée.
De quoi est dépendante la vitesse initiale ?
- elle est proportionnelle à la concentration en enzyme lorsque le substrat est en excès (droite passant par l’origine).
- Elle est fonction de la concentration initiale en substrat.
On détermine la vitesse initiale d’une réaction enzymatique avec des concentrations initiales de substrat variables.
On obtient une nouvelle courbe, également d’allure hyperbolique.
Remarque : attention, cette courbe ressemble fortement à la courbe permettant de déterminer la vitesse initiale, il faut donc bien faire attention au type de courbe [P] = f(t) ou Vi = f[S]).
Quelles sont les trois phases de l’augmentation de la vitesse initiale liée à la concentration en substrat ?
- phase linéaire : la vitesse initiale est proportionnelle à la concentration initiale en substrat ;
- phase décroissante : l’augmentation de la Vi n’est plus linéaire et devient moins rapide ;
- phase de saturation : la vitesse initiale atteint une valeur maximale.
À partir d’une certaine concentration initiale de substrat, la vitesse initiale n’augmente plus car tous les sites catalytiques des enzymes sont occupés.
La vitesse initiale maximale Vmax est une constante pour une enzyme donnée.
Que permet l’équation de Michaelis et Menten ?
Elle permet de relier la vitesse initiale à la concentration de substrat initiale :
Vi = (Vmax x [S]i) / (Km + [S]i)
L’équation montre que Km correspond à la concentration initiale de substrat pour laquelle la vitesse initiale est égale à Vmax/2.
La valeur de Km peut donc être déterminée graphiquement
Que peut on déduire d’une réaction qui a une Km faible et une Vmax élevée ?
Celle-ci sera très active.
Qu’est ce que l’équation de Lineweaver Burk ?
Si on inverse l’équation de Michaelis et Menten, on obtient l’équation suivante :
1/Vi = (Km / Vmax) x (1/ [S]i) + (1/ Vmax)
Cette équation correspond à une fonction affine (ax+b), représentée graphiquement par une droite.
Ce qui implique que le coefficient directeur = Km/Vmax, l’ordonnée à l’origine = 1/Vmax).
On peut ainsi déterminer graphiquement les valeurs de Vmax et de Km.
Comment détermine t-on graphiquement les valeurs de Vmax et de Km avec l’équation des double inverse?
On calcule les inverses des valeurs des vitesses initiales et des concentrations initiales de substrat, et on trace la courbe 1/Vi = f(1/[S]).
On obtient une droite qui coupe les deux axes du repère.
L’ordonnée à l’origine est égale à 1/Vmax.
L’abscisse du point d’intersection avec l’axe des abscisses est égale à -1/Km.
Quels sont les deux effecteurs physiques ?
Température et pH
Sur quel paramètre influe la température dans une réaction enzymatique ?
La vitesse initiale
A quoi ressemble la courbe représentant la vitesse initiale en fonction de la température ? Pourquoi ?
Elle comprend deux parties :
- Dans un premier temps, la vitesse augmente linéairement avec la température, jusqu’à une valeur maximale.
- Ensuite, la vitesse diminue assez rapidement et s’annule.
La partie croissante (entre 0 et 40 °C le plus souvent) s’explique par l’énergie thermique croissante fournie au système.
Cette énergie entraîne l’agitation des molécules et facilite leur rencontre. L’énergie d’activation de la réaction est ainsi diminuée, ce qui augmente la vitesse.
Lorsque la vitesse initiale maximale est atteinte, on parle de température optimale.
Au-delà de cette température, la protéine est rapidement dénaturée : elle subit des modifications structurales, ce qui l’empêche de se lier au substrat, et elle perd son activité catalytique.
Quelle est la température optimale des enzymes corporelles ?
Entre 35 et 40 °C.
L’activité du métabolisme cellulaire est donc dépendante de la température.
L’homme maintient sa température corporelle à 37 °C, car cette température est optimale pour l’activité enzymatique et donc pour le métabolisme.
Toute variation de la température corporelle entraîne des perturbations du métabolisme qui peuvent être graves (hypothermie < 35 °C, fièvre > 40 °C).
Remarque : certaines enzymes sont adaptées à des conditions de température élevée (bactéries thermophiles).
Comment le pH perturbe t-il l’activité enzymatique ?
Il perturbe rapidement l’activité enzymatique, avant même que la structure protéique ne soit dénaturée.
Il peut entraîner des modifications du degré d’ionisation de certains groupements fonctionnels au niveau de l’enzyme (acides aminés acides ou basiques) et de son substrat.
La modification des charges empêche la formation du complexe enzyme-substrat.
Qu’est ce que le pH optimal ? Quel est le pH optimal de enzyme corporelle?
Dès que l’on s’écarte de cette valeur, la vitesse diminue rapidement. (courbe de gausse)
La plupart des enzymes corporelles ont il est voisin de 7 (pH des liquides physiologiques), mais certaines enzymes présentent un pH optimal différent.
Exemple
La pepsine est une enzyme gastrique spécialisée dans l’hydrolyse des liaisons peptidiques. Elle a un pH optimal voisin de 2 adapté au pH acide de l’estomac.
Comment le pH influe t-il sur les réaction réversibles ?
Pour certaines enzymes catalysant des réactions réversibles, le pH optimal peut être différent selon le sens de la réaction.
Le pH agit donc comme un effecteur capable de moduler l’activité enzymatique.
Exemple
La lactate déshydrogénase (LDH) est une enzyme du cytoplasme qui catalyse la transformation réversible du pyruvate en lactate.
Pyruvate + NADH + H+ ⇄ Lactate + NAD+
Le pH du cytoplasme de la cellule varie en fonction des circonstances physiologiques. Le pH optimal de l’enzyme est différent pour la réaction avec le pyruvate comme substrat (7,2) ou pour la réaction inverse avec le lactate (9).
Quels inhibiteurs enzymatiques distingue t-on ?
- compétitif
- inhibiteur non compétitif
Qu’est ce qu’un inhibiteur compétitif ?
Ces effecteurs présentent une analogie de structure avec le substrat normal de l’enzyme et sont reconnus par le site actif de l’enzyme.
Leur fixation sur le site actif empêche la formation du complexe E-S.
La présence simultanée de l’inhibiteur et du substrat entraîne une compétition pour occuper le site actif de l’enzyme.
Quelles sont les possibilités pour une enzyme en présence d’un inhibiteur compétitif ? De quoi va dépendre l’orientation cers telle ou telle possibilité ?
Deux possibilités s’offrent à l’enzyme : fixer le Substrat ou l’Inhibiteur
L’orientation vers telle ou telle possibilité dépend :
- des concentrations en substrat et en inhibiteur,
- de l’affinité de l’enzyme pour le substrat et pour l’inhibiteur.
Comment les paramètres cinétiques sont ils impactés par l’addition d’un inhibiteur compétitif ?
Cela favorise la dissociation du complexe ES.
Km augmente, donc l’affinité pour le substrat est diminuée.
Pour contrecarrer l’effet de l’inhibiteur, il faut augmenter la concentration de substrat.
La Vmax n’est pas affectée : elle sera seulement plus longue (+ de [S]i ) à atteindre.
Qu’est ce que la rétro-inhibition ou rétrocontrôle négatif ?
Lorsque le produit de la réaction enzymatique sert d’inhibiteur compétitif.
Qu’est ce qu’un inhibiteur non compétitif ?
L’inhibiteur se fixe sur un site effecteur distinct du site actif.
Il n’y a pas compétition entre le substrat et l’inhibiteur.
Comment les paramètres cinétiques sont ils impactés par l’addition d’un inhibiteur non compétitif ?
L’affinité de l’enzyme pour le substrat n’est pas modifiée : Km ne varie pas.
Seul le couple E-S peut aboutir à une activité catalytique, la Vmax est donc diminuée.
Une augmentation de la concentration de substrat ne peut pas s’opposer à l’effet de l’inhibiteur.
Que peut on déduire d’une courbe vitesse / substrat sigmoïde ?
il s’agit d’une enzyme ne correspondant pas au modèle michaelien : Elle est allostérique
L’allure de la courbe est caractéristique d’une enzyme possédant une structure quaternaire : c’est-à-dire une enzyme oligomérique constituée de plusieurs sous-unités.
Elle possède autant de sites actifs que de sous-unités.
L’occupation d’un des sites actifs par le substrat modifie l’affinité des autres sites pour le substrat (comme l’hémoglobine avec l’O2).
Qu’est ce que l’effet coopératif d’une enzyme allostérique ?
La fixation d’une première molécule de substrat entraîne une légère modification conformationnelle de la protéine, qui facilite la fixation d’une deuxième molécule de substrat sur un deuxième site.
Plus l’enzyme a fixé de substrat, plus son affinité pour celui-ci augmente, ce qui explique l’allure de la courbe.
Qu’est ce que la transition allostérique ?
C’est le passage de la forme T à R et inversement.
L’enzyme présente deux types de conformations : une forme tendue T présentant peu d’affinité pour le substrat, une forme relâchée R présentant une forte affinité pour le substrat.
La fixation du substrat sur l’une des sous-unités favorise le passage de la forme T vers la forme R.
Comment se présent la courbe vitesse / substrat d’une enzyme allostérique ?Pourquoi y a t-il différente phase ?
Elle est sigmoïde :
- Partie 1 : avec peu de substrat, l’affinité de l’enzyme pour le substrat est faible. La vitesse initiale augmente lentement.
- Partie 2 : dès que l’enzyme commence à fixer le substrat, son affinité augmente. La vitesse initiale augmente rapidement.
- Partie 3 : la vitesse initiale augmente moins rapidement. L’enzyme est presque saturée.
- Partie 4 : l’enzyme est saturée. La vitesse initiale est maximale.
