Inst 2-Gelelektrofores Flashcards
Vad är gelelektrofores, och vad används det till?
Separerar DNA, RNA eller protein efter storlek med elektrisk spänning.
Vilka två olika typer av geler används vid gelelektrofores?
Agarosgel – för DNA/RNA, polyakrylamidgel – för små DNA/proteiner.
När man tillsätter DNA-fragment i en gel används ofta en sockerlösning och ett färgämne. Varför är dessa viktiga?
Sockerlösning gör DNA tyngre, färgämne visar migration i gelen.
Vad är en DNA-stege, och vad används den till?
Blandning av DNA-fragment med känd storlek för jämförelse.
Hur kan en DNA-stege hjälpa vid analys av DNA-fragment?
Gör det möjligt att bestämma fragmentstorlek genom jämförelse.
Varför rör sig DNA-molekyler genom gelen vid en elektrisk spänning?
DNA är negativt laddat och vandrar mot den positiva polen.
Vilka DNA-fragment rör sig snabbast i gelen: långa eller korta? Förklara varför.
Korta fragment – möter mindre motstånd i gelen.
Vad är en probe och hur används den vid DNA-analys?
Märkt DNA-sekvens som binder specifikt mål-DNA vid hybridisering.
När används SDS-PAGE, och vad är dess huvudsakliga syfte?
Separera proteiner efter storlek genom att denaturera dem.
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)
SDS är ett anjoniskt detergent som denaturerar proteiner genom att binda till deras polypeptidkedjor. Det ger proteiner en negativ laddning, vilket gör att de separeras i elektrofores beroende på storlek snarare än laddning.
Polyakrylamidgel
Polyakrylamidgel används som matrix i SDS-PAGE för att separera proteiner. Gelens porstorlek styr separationen av proteiner baserat på deras molekylvikt.
Proteinladdning
Proteinprover laddas in i brunnar i gelens övre del. SDS och reduktionsmedel (som DTT eller 2-mercaptoethanol) används för att reducera disulfidbindningar och ge proteinerna en negativ laddning så att de kan separeras effektivt.
Molecular Weight Marker (MW marker)
En molekylviktmarkör, eller laddarledare, är ett standardprotein som används för att uppskatta storleken på de separerade proteinerna genom att jämföra deras position i gelen.
Denaturering
Denaturering i SDS-PAGE innebär att proteiner förlorar sin tredimensionella struktur (funktionella form) och omvandlas till linjära kedjor. Detta sker på grund av SDS, som binder till proteiner och denaturerar dem.
Reduktion
Reduktion av disulfidbindningar mellan cysteinrestar sker under SDS-PAGE genom att använda reduktionsmedel. Detta gör att proteinerna inte behåller några sekundära eller tertiära strukturer, vilket gör att de separeras helt baserat på deras primära struktur.
